1990 Fiscal Year Annual Research Report
先天性高乳酸血症細胞におけるピルビン酸脱水素酵素活性化障害の分子生物学的研究
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02670443
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
黒田 泰弘 徳島大学, 医学部, 教授 (20035471)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
伊藤 道徳 徳島大学, 医学部・附属病院, 助手 (40211057)
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| Keywords | ピルビン酸脱水素酵素 / 活性化障害 / 高乳酸血症 / DNA / 塩基配列 / 先天代謝異常症 |
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| Research Abstract |
先天性高乳酸血症の原因としてピルビン酸脱水素酵素(PDH)複合体の活性化障害が注目されている。PDH活性化障害はPDHを活性化する作用をもつPDHホスファタ-ゼの欠損,PDHホスファタ-ゼの基質であるPDH蛋白質そのものの構造異常等に基ずくことが考えられる。本研究ではPDH蛋白質の構造異常に焦点を合わせて蛋白質レベルと遺伝子レベルの両面から病因を検討し,下記の研究実績を上げた。
1)PDH複合体を牛心臓から精製し,精製PDHを家兎に免疫することにより抗PDH複合体抗体を作製した。
2)PDH活性化障害が認められる坂天性高乳酸血症患者由来の培養皮膚線維芽細胞から分離したミトコンドリア蛋白質と抗PDH複合体抗体を用いてウエスタン・ブロット法でPDH蛋白質の異常を検討した。3例中2例ではPDHのαおよびβサブユニット蛋白質量の著明な減少がみられた。一方,残りの1例ではPDHのαおよびβサブユニット簑白質量に対照細胞との差異がみられなかった。また全例においてPDH分子の大きさに異常はみられなかった。
3)対照細胞から全RNAを抽出し,逆転写酵素によりcDNAを作製した。ついで,すでに報告されているPDHのαおよびβサブユニットのcDNAの塩基配列を参考にして合成した特異的なプライマ-を用いてPCR法によりαおよびβサブユニットの全coding regionをカバ-するcDNAを増幅し,さらにクロ-ニングした。
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