Bacteroides産生コラゲナーゼの産生制製機構について

1992 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 02670862
• Research Institution: HYOGO COLLEGE OF MEDICINE
• Principal Investigator: 柳沢 高道 兵庫医科大学, 医学部, 講師 (50118585)
• Keywords: B.gingivalis / コラゲナーゼ / 精製

Research Abstract

コラゲナーゼ抗体による方法を検討する目的でBacteroides gingivalisコラゲナーゼの精製を試みた。Bacteroides gingivalis(ATCC 33277)の菌体を超音波破砕し遠心分離して得られた上清画分を粗標品とした。得られた上清を30-60%飽和硫酸アンモニウムにて分画した。その結果30%飽和硫酸アンモニウム塩析試料に最も高いコラゲナーゲ活性を認めた。活性値の高い試料を透析、脱塩後凍結乾燥した。凍結乾燥試料を適当量の緩衝液に溶解し、遠心分離した上清をSephacryl S-300HRを充填したカラムでゲル濾過した。その結果活性のピークが二つみられた。そこでこれを1つにまとめて、アフィニティークロマトグラフィーを行った。つまり緩衝液(0,05M Tris-HCl pH7,6 0,5M NaCl 0,05M CaCl_2 0,02% Brij 35)によって平衡化したGeratin-Sepharose 4Bカラム(1,5×5cm)にアプライした。同緩衝液により十分洗浄後0,05M Tris-HCl pH 7,6 0,5M NaCl 0,05M CaCl_2 0,02 Brij 35に10% DMSOを加えた緩衝液にて溶出させた。その結果コラゲナーゼ活性のピークがゲル濾過と同様に2つみられた。2つの活性に差がみられなかったためピークの画分を1つにまとめ透析した。さらに透析して得られた試料を限界濾過した。その結果、コラゲナーゼの精製の指標としている活性値が精製操作が進にしたがい低下し、限界濾過による濃縮時点では濾過前試料、濃縮試料ならびに通過試料との間の酵素活性に有意の差が認められなかった。B.gingivalisコラゲナーゼが膜結合型酵素であるため、細胞膜からはずれたコラゲナーゼはその酵素活性が非常に不安定である可能性が示唆された。本研究は形質転換した大腸菌のスクリーニング方法の確立の段階でその方法を暗中模索している状態であった。しかしコラゲナーゼ遺伝子のクローニングが成功した(Katoら,1992)ため、今後はコラゲナーゼプライマーを人工的に合成し実験を進めて行きたい。