培養神経細胞を用いた向精神薬作用の定量化ー受容体結合とグルコ-ス代謝・イオン輸送変化の関係に基づくスクリ-ニング法の開発ー

1990 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 02671049
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 澤田 康文 東京大学, 医学部, 助教授 (80114502)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 杉山 雄一 東京大学, 薬学部, 助教授 (80090471)
• Keywords: 培養神経細胞 / 分離神経細胞 / グルコ-ス / 3ーOーmethylglucose / 2ーdeoxyglucose / muscimol

Research Abstract

既に保有しているクリ-ンベンチ、二酸化炭素培養器、更に今回の研究費で購入したオ-トクレ-ブを使用することにより、培養小脳細胞を採取することが可能となった。以下に今回成功をおさめた簡単な実験方法を示す。確定妊娠ラットの胎児脳(16日胚)を取り出し特定核(海馬)を切り出す。酸素処理、細胞分散を行い、polyethylenimineでコ-トしたディッシュ、プレ-トに蒔いたあとアラビノフラノシトシン存在下で培養器にかける。神経細胞の培養が成功したかどうかの確認には、ニュ-ロフィラメント、ニュ-ロン特異性エノラ-ゼを、アストログリアの混在がどの程度有るかどうかの確認にはglial fibrillary acidic proteinなどを検知するための免疫ケイ光法を用いた。その結果、得られた培養細胞はほとんどが神経細胞であることがあきらかとなった。更に予試験的にGABAアゴニストである ^3Hーmuscimolの特異的結合を測定したところ高親和性の特異的結合が見いだされており、培養した細胞がGABAニュ-ロンであることが確認出来た。また培養神経におけるグルコ-スの利用率を測定する方法論を確立するために、その前段階として分離分散細胞を用いた ^3Hー3ーOーmethylglucose(3ーOMG)と ^<14>Cー2ーdeoxyglucose(2DG)の細胞内取り込みキネティックス(膜透過と細胞内リン酸化)を検討した。3ーOMGは時間と関係なくほぼ一定の取り込み量を示すものの、2ーDGは時間と共に蓄積が増加して、細胞内への2ーDG6ーリン酸の生成が確認できた。今後は更に培養細胞を用いて同様の方法論の確立を目指し、種々向精神薬によるグルコ-ス利用率の変化を定量的に捉え、スクリ-ニング法としての有用性を検討する。