合成高分子分解遺伝子のクローニングと解析

1992 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 02806023
• Research Institution: KOBE UNIVERSITY OF COMMERCE
• Principal Investigator: 河合 富佐子 神戸商科大学, 商経学部, 教授 (60118007)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 島田 良美 神戸商科大学, 商経学部, 助手 (80226216)
• Keywords: 合成高分子 / ポリエチレングリコール(PEG) / 分解資化能 / PEG脱水素酵素 / ジーンライブラリー / クローニング / PCR反応 / 合成オリゴヌクレオチドプローブ

Research Abstract

(1)PEG資化菌の再同定:PEG400から20,000資化菌を化学分類学的性状や、DNA/DNA相同性などの手法で再同定した。PEG4000以上の資化菌がすべてSphingomonas属であることが明らかになり、いずれも新種のS.macrogoltabidus(PEG4,000資化菌)、S.terrae(PEG20,000資化共生菌)と命名した。
(2)Sphingomonas macrogoltabidus No.203のPEG脱水素酵素遺伝子のPCRによる増幅:前年度に増幅されたDNA断片(pegA A)については、その塩基配列を決定した結果、全長289bpであり、両端にはそれぞれプライマーの配列が確認された。また、前年度に合成したPCRプライマーを用いてさらに検討したところ、PQQ結合部位から上流側約500bpの断片が増幅された。このpegA B断片についても塩基配列を一部読みとったが、相当するアミノ酸配列とは一致しなかった。
(3)pUC119およびCharomid9-36によるジーンライブラリーの作成とコロニーハイブリダイゼーション:本菌の染色体DNAのSal I消化断片を、pUC119またはCharomid9-36に挿入し、大腸菌JM109においてジーンライブラリーを作成した。(1)で得られたpegA A断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーションを行ったが、どちらのライブラリーについても陽性のクローンは得られなかった。
(4)EMBL3によるジーンライブラリーの作成とプラークハイブリダイゼーション:本菌の染色体DNAのMbo I消化断片を、EMBL3に挿入し、大腸菌ER1647においてジーンライブラリーを作成した。PCRプライマーとして合成したオリゴヌクレオチド2種を新たにプローブとしてプラークハイブリダイゼーションを行ったが、陽性のクローンは得られなかった。
(5)PEGの細菌外膜透過性と分解能:PEG資化菌では一般に、PEG培地で分解酵素が誘導され、外膜にポーリンが形成されることから、ポーリンを含む外膜構造がPEG分子の透過性に関与していることがうかがえたが、S.macrogoltabidus No.203では、例外的にPEGによる誘導効果が認められなかった。本菌は遺伝子に何らかの変異が生じて、酵素の誘導機構および細胞膜構造が変化したものと推測された。

Research Products

• [Publications] M.Takeuchi,F.Kawai,Y.Shimada and A.Yokota: "Taxonomic Position of Polyethylene Glycol-Utilizing Bacteria:Proposal of Sphingomonas peglytica sp.nov.and Sphingomonas parapeglytica sp.nov." Sys.Appl.Microbiol.(1993)
• [Publications] F.Kawai: "Biodegradable Polymers and Plastics (M.Vert,Ed.)" Royal Society of Chemistry, 10 (1992)