ハプテン、殊に低分子ペプチドの新しい超高感度測定法の開発と応用

1991 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 02808029
• Research Institution: Miyazaki Medical College
• Principal Investigator: 橋田 誠一 宮崎医科大学, 医学部, 助教授 (10156268)
• Keywords: ペプチド / ハプテン / 酵素免疫測定法 / エンザイムノムノアッセイ / ビオチン / ペルオキシダ-ゼ / βーDーガラクトシダ-ゼ / ストレプトアビジン

Research Abstract

最近、生体内の新しいペプチドが次々と発見されてきたが、それらの生体内濃度は低いので、高感度な測定法の開発が求められている。従来から、ペプチドなどのハプテンは主としてcompetitive radioimmunoassayにより測定されてきたが、感度はfemtomoleレベルであった。このため、ペプチドなどのハプテンをattomoleレベルで測定するための新しいnoncompetitive immunoassay法(2点結合免疫測定法)の開発を試みた。〈方法〉ペプチドをビオチン化して、ビオチン化ペプチドを抗ペプチド抗体不溶化固相上にトラップする。固相を洗浄することにより他のビオチン化物質を除いた後、ビオチン化ペプチドを固相より酸性条件下で溶出する。溶出したビオチン化ペプチドとDNP標識フルオレセインジスルフィド結合ウシ血清アルブミン抗ペプチド抗体を反応させ、生成した複合体を抗DNP抗体不溶化固相上にラップして、固相を洗浄する。ついで、固相上にトラップされているビオチン化ペプチドとβーDーガラクトシダ-ゼ標識アビンを反応させた後、固相を洗浄する。DNPーリジンにより、複合体を固相から溶出して抗フルオレセイン抗体不溶化固相上にトラップして固相を洗浄する。最後にメルカプトエチルアミンにより複合体を固相から溶出して抗IgG抗体不溶化固相上にトラップして、固相に結合したβーDーガラクトシダ-ゼ活性を測定する。〈結果〉種々の条件を検討した結果、1amolのアルギニン・バゾプレッシン、αー心房性ナトリウム利尿ホルモン、アンギオテイシンIなどが測定できるようになった。また、血漿中のたんぱくを分子篩により除去して血漿中のペプチドを濃縮することなく高感度で測定しうるようにした。今後、免疫複合体の転移を効率良く行うために種々のハプテンー抗ハプテン抗体などの組合わせを検討し、さらに高感度化を進める予定である。

Research Products

• [Publications] Seiichi Hashida,et al.: "Novel and sensitive noncompetitive enzyme immunoassay(heteroーtwoーsite enzyme immunoassay)for arginine vasopressin in plasma." Analytical Letters. 24. 1109-1123 (1991)
• [Publications] Seiichi Hashida,et al.: "Novel and sensitive noncompetitive enzyme immunoassay(heteroーtwoーsite enzyme immunoassay)for αーhuman atrial natriuretic peptide in plasma." Journal of Clinical Laboratory Analysis. 5. 324-330 (1991)
• [Publications] Seiichi Hashida,et al.: "Detection of one attomole of[Arg^8]ーvasopressin by novel noncompetitive enzyme immunoassay(heteroーtwoーsite complex transfer enzyme immunoassay)." Journal of Biochemistry. 110. 486-492 (1991)