オステオポンチンーガン転移における意義と発現機序の解析

1991 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 03152103
• Research Institution: 大分医科大学
• Principal Investigator: 山本 俊輔 大分医科大学, 医学部, 教授 (90040188)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 瀬戸口 美保子 大分医科大学, 医学部, 助手 (20236110) ; 樋口 安典 大分医科大学, 医学部, 助教授 (60040284) ; 秋月 真一郎 大分医科大学, 医学部, 助手 (80159334)
• Keywords: オステオポンチン / B16 / ハプトタキシス / トランスジェニックマウス / オステオポンチン遺伝子発現

Research Abstract

1)リコンビナントオステオポンチン(rOP)の分離:マウスおよびヒトOPcDNAを種々のベクタ-で発現を試みた。マウスではpETで発現をみたが、発現が弱く、利用出来る程のrOPは得られなかった。現在、他のベクタ-で発現を試みている。ヒトではpETで大量発現し、これをHPLCで精製した。さらにGRGDSのDをEに変異させた蛋白の発現を試みている。2)rOPによるガン細胞の接着実験:BSA,OP,フィブロネクチン(FN),合成ペプチドGRGDSを塗布乾燥したマトリクスを用いてB16およびMφ株P388D1の付着を観察し、rOPにはFNに匹敵する活性が存在することを確認した。OP処理B16細胞のOP,FN,GRGDSに対する付着の抑制がおこることも観察した。3)ハプトタキシス(HT)におけるrOPの作用:rOP処理ポリカ-ボネ-ト膜(孔径5〜8μ)でのB16のHTは見られない。GRGDSも同様である。FNには濃度依存的にHT活性が見られる。FN処理膜を用い、Boyden装置の下室にrOPを入れるとHTの抑制が認められた。FN処理膜をrOPで再処理すると強い抑制が見られた。また、B16をrOPで処理した場合にもHTの抑制が見られた。現在肺転移巣から高転移性クロ-ンの選別を行っており、rOPを用いたin vivo実験はこれを用いて行う予定である。また、抗rOP抗体を作成し、特異性を確認した。4)OPトランスジェニックマウス(TM)の作成:メタロチオネインプロモ-タ-を連結したマウスOP遺伝子を作成し、BALB/cマウスのTMを作出中である。すでに数匹の出産をみたが、ゲノムDNAのPCRによる検定はこれからである。5)OP遺伝子の発現機序解析:すでにマウスOPゲノム遺伝子の転写開始部上流約3kbの塩基配列を決定した。また、ヒトOPゲノム遺伝子の塩基配列の検索も行っている。これらのプロモ-タ-領域をクロラムフェニコ-ルアセチルトランスフェラ-ゼベクタ-に入れ、ガン細胞における特異的転写およびTPAによる転写亢進に関与するシスエレメントを検討している。

Research Products

• [Publications] 山本 俊輔: "分泌リン蛋白ー1(オステオポンチン)構造と機能および利用について" バイオインダストリ-. 5. 319-327 (1991)
• [Publications] Higuchi,Y.: "Inhibition of fibronectin-induced haptotactic migration of murine melanoma B16 by osteopnotin"
• [Publications] Hijiya,N.: "Sequence conservation in potential regulatory regions of the human and mouse osteopontin gene"
• [Publications] Setoguchi,M.: "Identification of a tumor-specific regulatory element within the murine and human osteopontin gene"