1991 Fiscal Year Annual Research Report
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03236204
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
千葉 誠哉 北海道大学, 農学部, 教授 (30001449)
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| Keywords | βーアミラ-ゼ / マルタ-ル / アイソト-プ効果 / αーグルコシダ-ゼ / 水和反応 |
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| Research Abstract |
(1)サツマイモおよびダイズのβーアミラ-ゼを二重結合を有する特殊基質、maltalに作用させ、生成する2ーdeoxymaltoseのアノマ-型をGLC法を用いて調べた。両酵素ともβーアノマ-を生成していることが明らかになった。次に、基質二重結合の付加方向を ^1HーNMRを用いて決定した。酵素反応をD_2O中で行い、生成する2ーdeoxyー[2ー ^2H]maltoseの ^1HーNMR解析から、両酵素はシス方向から二重結合を水和することが判明した。これまで、解明された多くの酵素的水和反応はすべてトランス付加であり、βーアミラ-ゼはシス付加を行う初めての酵素である。D_2O中で行った速度論的解析から、この酵素的水和反応は著しいアイソト-プ効果(V_H/V_D=6.5)を示した。
(2)Aspergillus niger αーグルコシダ-ゼの全一次構造をエドマン法を用いて決定した。本酵素は2つのサブユニット(P1およびP2と略称、分子量はそれぞれ約3.5×10^4および約9.8×10^4)から構成されている。還元ピリジルエチル化後、HPLCで分離精製したP1およびP2をリジルエンドペプチダ-ゼで消化した。得られた各ペプチド(LYペプチドと略称)をさらに各種プロテア-ゼおよびBrCN処理により断片化した。各ペプチド断片は気相シ-クエンサ-を用いて配列解析し、全てのLYペプチドのアミノ酸配列を明らかにした。各LYペプチドの連結はP1およびP2を再びAspーNプロテア-ゼやV8プロテア-ゼ消化あるいはAspーPro結合の化学的切断により、得られたペプチドを用いて行い、P1およびP2サブユニットの全一次構造を決定した。その結果、P1は227個の、P2は719個のアミノ酸残基から構成されていることが明らかになった。
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[Publications] S.Kitahata: "Mechanism of Maltal Hydration Catalyzed by βーAmylase:Role of Protein Structure in Controlling the Steric Outcome of Reaction Catalyzed by a Glycosylase" Biochemistry. 30. 6769-6775 (1991)
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[Publications] 松井 博和: "アイソト-プ効果によるエキソーαーグルカナ-ゼの反応機構の解析" 澱粉科学. 38. 181-185 (1991)
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[Publications] N.Shimomura: "Cysteinーconjugate βーlyase from Mucor javanicus" Biosci.Biotech.Biochem.58. (1992)
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[Publications] H.Mori: "Nucleotide and derived amino acid sequence of a catalase cDNA isolated from rice immature seeds" Plant Mol.Biol. 18. (1992)
