膜タンパク質スーパーコンプレックスの構築原理と結晶化条件の解明

1993 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 03304056
• Research Institution: Himeji Institute of Technology
• Principal Investigator: 吉川 信也 姫路工業大学, 理学部, 教授 (40068119)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 美宅 成樹 東京農工大学, 工学部, 助教授 (10107542) ; 豊島 近 東京工業大学, 生命理工学部, 助教授 (70172210) ; 月原 富武 徳島大学, 工学部, 教授 (00032277) ; 白木原 康雄 兵庫教育大, 自然系物理, 助教授 (20150287) ; 神山 勉 理化学研究所, 先任研究員 (30170210)
• Keywords: 膜タンパク質 / 結晶化 / X線結晶構造解析 / 結晶成長機構 / タンパク質立体構造予測 / 超分子複合体 / タンパク質立体構造形成機構 / 電子線構造解析

Research Abstract

膜タンパク質スーパーコンプレックスの構築原理と結晶化条件の一般化に関して以下のことが明らかになった。膜タンパク質の立体構造の安定化の要因は膜貫通ヘリックス間の水素結合と静電的相互作用である。それに加えて、親水性部分が安定化に寄与している。したがって、脂質二重膜に埋まった疎水性表面を界面活性剤で覆って水溶液中に｀可溶化｀することは立体構造を損なわずに膜タンパク質を単離する最もよい方法であろう。しかし、この結合している界面活性剤を介した相互作用は非特異的で、結晶の安定化に寄与するとは考えられない。したがって、親水性部分の大きな膜タンパク質ほど結晶化は容易であると推定できる。ウシ心筋チトクロム酸化酵素やチトクロムbc_1複合体は結晶化されているが分子量がそれらの約1/2である細菌の相同タンパク質はまだ結晶化されていないことは、この推定を支持している。結晶化の必要条件は標品の純度ではなく立体構造が完全であることである。さらに周期的な配列が可能になるためには、必ずしも分子間の相互作用が強ければよいわけではない。界面活性剤の種類によってこのような相互作用を制御することができる。例えば、チトクロム酸化酵素結晶品のx線回折の分解能を6.5Åから3.5Å以上に、界面活性剤の種類を変えることによって、一挙に向上させることができた。巨大な分子の結晶では、安定化を促進する相互作用が体積当たりでは弱くなるため、結晶の完全性に限界があるという説もあるが、逆にいくら大きくてもそれが生理活性をもったタンパク質であるかぎり結晶化は可能であるとも考えられる。何故なら大きなタンパク質ほど立体構造の動的なゆらぎを小さくするような構造があるため、全体として安定であるだけでなく、特異的な相互作用も揺らぎが小さいだけ強くなるであろうからである。

Research Products

• [Publications] 新村伸雄: "Small angle neutron scatlering from lysozyme in unsaturated solutions to chracterize the pre-crystallization process" J.Cryst. Growth. im press. (1994)
• [Publications] 小田原孝行: "Determination of phase diagrom to elucidate the crystal growth of Rhodobactor spheroides photorection center" Acta Crystallographica, Part D. im press. (1994)
• [Publications] 別所康男: "Analysis of the crystallization kinetics of lysozyme using a model with polymuclear growth mechanism" Biophysical Jownal. 66. 310-313 (1994)
• [Publications] 安宅光雄: "Protein crystal growth: An approach based on phase diagiam determiaation" Phase Transitions. 45. 205-219 (1993)
• [Publications] 神谷信男: "X線結晶学とシンクロトロン放射光-新しい光への大きな期待-" 生物物理. 33. 36-37 (1993)
• [Publications] T. Kouyama: "Polyhedral aosembly of a membrane protein in its 3Dcrystal" J. Mal. Biol. im press. (1994)
• [Publications] T. Kouyama: "Bacteriorhodopsin, a biological protom pump working in the light" RIKEN Review. 1. 5-6 (1993)
• [Publications] Y. Shirakihara: "Purification by Dye-ligand chromatography and a Crystallization study of the Fi-ATPase and its Majour subunits,beta and alpha from a thermophilic Bacteri" J.Biochem. 909. 466-471 (1991)
• [Publications] 月原冨武: "超分子複合体の構造決定 どこまで大きな分子に迫れるか?" 生物物理. 33. 24-40 (1993)
• [Publications] 月原冨武: "超分子複合体のX線結晶構造解析" 蛋白質 核酸酵素. 38. 1247-1253 (1993)
• [Publications] P. Briozzo: "Crystallization and Preliminary X-ray diffraction studies of c-1027-AG, the Apoprotein of the Macromolecular Antitumor Antibrotic C-1027 from Stereptomyces globisporus" Acta Crystallogr.D49. 372-374 (1993)
• [Publications] T. Hayano: "PDI and Glutathione-Mediated Reduction of the Glutathionylated Variant of Human Lysozyme" FEBS Lett.328. 203-208 (1993)
• [Publications] K. Miki: "Crystallization and Preliminary X-ray Diffraction studies of Photolyase (Photoreacting Enzyme) from the lyanobacterium Anacystis nidulans" J. Mol. Biol.233. 167-169 (1993)
• [Publications] H. Nakane: "Crystallization and Preliminary X-ray Diffraction Studies of Bacillusstearothermophilus Farne〓yl diphosphate synthase expressed in E. Coli" J.Mal. Biol.233. 787-785 (1993)
• [Publications] 三木邦夫: "蛋白工学とコンピューター 蛋白質のX線結晶構造解析" CICSJ Bulletein. 11(4). 29-32 (1993)
• [Publications] 三木邦夫: "生体高分子の単〓品構造解析における中性子回折" 波紋. 3(3). 17-21 (1993)
• [Publications] 三木邦夫: "特集「タンパク質結品守の新世代」新しいターゲットへの挑戦、膜タンパク質へのアプローチ-構造、機能の新天地への挑戦" 生物物理. 33. 324-328 (1993)
• [Publications] M. Suwa: "Characterization of Transmembrand helices by a probe helit of Molecular energy calculation" Jpn. J. Appl. Phys.31. 951-956 (1992)
• [Publications] C.Toyoshima: "Three-dimensional cryo-electron microscopy of the calcium ion pump in the sarcoplamisc reticulum membrane." Nature. 362. 469-471 (1993)
• [Publications] C. Toyoshima: "Contrast transfer for the frozen hydrated specimen. H:Amplitude contrast at very low frequencies." Ultramicroscopy. 48. 165-176 (1993)
• [Publications] A. Sato: "Two-dimensional crystallization of catalase on a monolayer film of poly (I-benzy1-L-histidine)spread at the air/water interface." Biochim.Biophys.Acta. 1162. 54-60 (1993)
• [Publications] 豊島 近: "膜蛋白質の電子線三次元構造解析" 蛋白質・核酸・酵素. 38. 1276-1286 (1993)
• [Publications] Nakayama,H.: "A Topographical Study of the E1ectroplax Sodium Channel with Site-Directed Antibodics" Biochim.Biophys.Acta. 1145. 134-140 (1993)
• [Publications] Kalasz,H.: "Identification of 1,4-Dihydropyridine Binding Domains within the primary Structure of the al Subunit of the Skclctal Muscle L-type Calcium Channel." FEBS Letters. 331. 177-181 (1993)
• [Publications] Watanabe,T.: "Azidobutyryl Clentiazen,A New Photoactivatable Diltiazem Analog Labels Benzothiazepine Binding Siter of the Calcium Channel." FEBS Letters. 334. 261-264 (1993)
• [Publications] H.Nakakma: "Methods in Pharmacology, Vol.7" Plenum Press, New York, 280 (1993)
• [Publications] 白木原康雄: "膜タンパク質の結晶解析" 日本生化学会編、 東京化学同人, 9 (1992)
• [Publications] M.Tsuda: "Frontiers of Photobiology" Elsevier Science Publishera, 568 (1993)
• [Publications] 三木邦夫: "化学使賢、基礎編II、改訂4版(日本化学会編)" 丸善,東京, 762 (1993)