キシラナーゼとセルラーゼの比較による構造機能相関の解析

1992 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 03453129
• Research Institution: Sojo University
• Principal Investigator: 岡田 弘輔 熊本工業大学, 工学部, 教授 (20028947)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 田口 久貴 熊本工業大学, 工学部, 助手 (90212018) ; 赤松 隆 熊本工業大学, 工学部, 助教授 (50133567)
• Keywords: キシラナーゼ / XynA / 蛋白質工学 / 人工化学変異 / 耐熱性 / F_1-CMCase / 立体構造

Research Abstract

B.pumilusのキシラナーゼ遺伝子を一本鎖DNAファージに組み込んだ。その組み換えファージDNAを試験管内突然変異処理し、変異型DNAを含む大腸菌を約6万個得た。それぞれについて60℃30分間熱処理した後の残存活性をキシラン-コンゴーレッドプレートの上で調べた。野生型キシラナーゼは不活性化されたが4株の変異体(N56,N102,N104,F1)は顕著な残存活性を示した。N56,N102,N104は亜硝酸処理で、F1はギ酸処理で得た。
耐熱性キシラナーゼを生産する変異型遺伝子の塩基配列を決定し、アミノ酸の変異を調べたところ、N56ではS26→W,G38→D,T126→Sに、N102ではG38→Dに、N104ではG38→S,R48→Kに、F1ではS12→Cに変化すると考えられた。亜硝酸処理で得た変異体はすべてG38の変異を含むこと、G38またはS12位置の単独変異で耐熱性を示すことより、これらの位置は耐熱性変換に関して重要であると考えられる。キシラナーゼ立体構造の表面のβシート上すなわち溶媒と接する位置にある点は注目に値する。
51℃から61℃の間で変異型および野生型キシラナーゼの耐熱性を調べ、熱失活速度定数(k)を算出した。それをもとに活性化エンタルピー、活性化エントロピーを求めた。N104ではエンタルピーの増加によって、その他はすべてエントロピーの減少によって熱に対して安定化した変異体であった。耐熱性の機構は両者で異なっていた。

Research Products

• [Publications] Arase,A.,T.Yomo,I.Urabe,Y.Hata,Y.Katsube,and H.Okada: "Stabilization of xylanase by random mutagnesis" FEBS letters. 316. 123-127 (1993)