キシラナーゼとセルラーゼの比較による構造機能相関の解析

1993 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 03453129
• Research Institution: The Kumamoto Institute of Technology
• Principal Investigator: 岡田 弘輔 熊本工業大学, 工学部, 教授 (20028947)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 田口 久貴 熊本工業大学, 工学部, 助手 (90212018) ; 赤松 隆 熊本工業大学, 工学部, 助教授 (50133567)
• Keywords: キシラナーゼ / xynA / 蛋白質工学 / 人工化学変異体 / 合成基質 / 高活性 / Fl-CMCase / 立体構造

Research Abstract

Bacillus.pumilusのキシラナーゼは、beta-キシロシダーゼの合成基質rho-ニトロフェニル-beta-_D-キシロピラノシド(pNPX)を加水分解できない。そこで、rho-ニトロフェニル-beta-_D-キシロピラノビオシド(pNPX2)を合成し、本キシラナーゼが作用するかどうか調べた。pNPX2の合成は、北岡等(1)の方法に従い、一部変更を加えた。変更点は、キシロビオースの代わりにキシロオリゴ糖(キシロビオース60%含有)を原料に用いた点と、合成後の精製に高速液体クロマトグラフィーを用いた点である。98%以上の純度を持つpNPX2標品を得た。この標品を基質に用いて分解活性を測定したところ、本キシラナーゼは、pNPX2を加水分解した。精製した酵素のpNPX2に対するKm値とVmax値は、それぞれ0.72mMと0.16U/mgであった。この結果より、pNPX2は、本キシラナーゼの有効な基質であり、キシラナーゼと基質の相互作用を調べるためのモデル基質になると判断した。
次に、pNPX2対する反応性の変化した変異型キシラナーゼの取得を試みた。NTG変異処理により得た10万個の変異体に対して検索したところ、pNPX2に対する反応性の高まった1株、XynAlを得た。精製したXynAlキシラナーゼの比活性は、野生型キシラナーゼの約5倍であった。反応性上昇の原因を調べたところ、Km値の減少ではなく、Vmaxの上昇であった。変異型遺伝子の塩基配列を決定し、アミノ酸配列の変異点を調べたところ、76番目のセリンがグリシンに変化した変異であった。変異部位は、大きな2つのベータシート間のライダムコイル上に位置していた。
(1)Kitaoka M.,Haga K.,Kashiwagi Y.,Sasaki T.,Taniguchi H.and Kusakabe I.1993.Kinetic studies on rho-nitrophenyl-cellobioside hydrolyzing xylanase from Cellvibrio gilvus.Biosci.Biotech.Biochem.57:1987-1989.

Research Products

• [Publications] Hirosuke Okada: "Comparison of primary,secondary and tertiary structure of xylanase of Bacillus pumilus and cellulase of Aspergillus acleatus" In T.Yoshida and R.D.Tanner(ed.),Bioproducts and Bioprocess. 2. 115-122 (1993)