ハブ毒ホスホリパ-ゼA_2アイソザイムのタンパク質工学及び遺伝子解析

1991 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 03453165
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 大野 素徳 九州大学, 理学部, 教授 (30038434)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 下東 康幸 九州大学, 理学部, 助手 (00211293) ; 青柳 東彦 九州大学, 理学部, 助教授 (80037267)
• Keywords: 徳之島ハブ毒 / 高活性型Aspー49ーホスホリパ-ゼA_2 / 低活性型Lysー49ーホスホリパ-ゼA_2 / cDNA / 発現 / ゲノム遺伝子 / 僞遺伝子 / ポリモルフィズム

Research Abstract

徳之島ハブ毒の高活性型Aspー49ーホスホリパ-ゼA_2(PLA_2)及び低活性型Lysー49ーPLA_2のタンパン質工学及び遺伝子解析の成果を要約する。
(1)ハブ毒PLA_2アイソザイムcDNAの調製
ハブ毒腺cDNAライブラリ-を多様なプロ-ブでスクリ-ニングして、6種のPLA_2もコ-ドするcDNAを単離した。非翻訳領域の相同性が翻訳領域のそれよりも高いこと、そしてトリプレットコトンの1位、2位及び3位の塩基置換の割合がほぼ等価であることがわかった。
(2)高活性型Aspー49ーPLA_2の発現研究
Aspー49ーPLA_2 cDNAを種々の発現ベクタ-に組み込み、多様な宿主菌を用いたが、発現しなかった。しかし、pBluescript IIに組み込み、JM109を形質転換したものが、IPTG誘導により大量に発現した。べクタ-由来のタンパク質との融合型であり、可溶化、X_a因子切断及び天然型への巻きもどしが必要である。条件を検討中である。
(3)Aspー49ーPLA_2アイソザイムのゲノム遺伝子の解析と発現様式
ハブ毒PLA_2アイソザイムのcDNA(mRNA)において、非翻訳領域の相同性が高いことの意味を調べるために、Aspー49ーPLA_2アイソザイムゲノム遺伝子の構造を解析した。肝臓DNAライブラリ-をAspー49ーPLA_2 cDNAでスクリ-ニングして、二つのクロ-ン、pgPLA1及びpgPLA2、を得た。ともに2.7及び2.4kbのAspー49ーPLA_2をコ-ドする遺伝子を含み、配列を決めた。すべてエキソン4個及びイントロン3個を含む。両クロ-ンの対応する遺伝子間で5塩基の置換があるが、2.7kb遺伝子は同じ成熟タンパク質をコ-ドしていた。一方、2.4kb遺伝子はTATA box上流に6塩基の欠落があり、発現もみられず、僞遺伝子と考えられた。2.7及び2.4kb遺伝子についてハブ個体間にポルモルフィズムがみられ、またアイソザイム遺伝子は多産遺伝子ファミリ-を形成していることがわかった。

Research Products

• [Publications] T.Ogawa,K.Nakashima,N.Oda,M.Ohno,H.Sasaki,M.Hattori,Y.Sakaki,H.Kihara: "Cloning and Sequeuce Analysis of cDNAs for Trimeresurus flavoviridis Phospholipase A_2 Isogymes:Unusually High Conservation of Untranslated Region Sequences" Proceedings of 10th World Congress on Animal,Plant and Microbial Toxins. (1992)
• [Publications] T.Ogawa,N.Oda,K.Nakashima,H.Sasaki,M.Hattori,Y.Sakaki,H.Kihara,M.Ohno: "Unusually High Conservation of Untrauslated Region Sequences in cDNAs for Trimeresurus flavovinidis Phospholipase A_2 Isozymes" The Proceeding of the National Academy of Sciences U.S.A.