DNAダギングによる植物遺伝子の効率的なクロ-ニング及びマッピング法の開発

1991 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 03454037
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 本吉 總男 岡山大学, 資源生物科学研究所, 教授 (90230052)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小倉 豊 岡山大学, 資源生物科学研究所, 助手 (60224193) ; 村田 稔 岡山大学, 資源生物科学研究所, 助教授 (20166292)
• Keywords: DNAタギング / 遺伝子 / クロ-ニング / マッピング / トマト / シロイヌナズナ / 形質転換 / in situハイブリダイゼイション

Research Abstract

DNAタギングによる遺伝子クロ-ニング及びマッピング手法を確立するため以下の実験を行なった。1.シロイヌナズナとトマトで形質転換法を基準化するために、後にDNAタギングに都合がよいと考えられるTiプラスミドベクタ-pGA482(カナマイシン耐性遺伝子、pBR322ori及びλcos領域をTーDNA上に有する)を含むアグロバクテリウムをそれらの植物の組織に接種することによって、形質転換を試みた。シロイヌナズナでは、エコタイプとしてColmbia及びWassileskija(WS)の根、葉または胚軸切片を用い、接種後カナマイシンを含む選択培地で培養した。その結果、いずれもカナマイシン耐性カルスを生じたが、その発生率はWSの胚軸で最も高かった。またこれらのカルスから個体が再生され、種子が得られた。トマトは葉切片を用いてpGA482による形質転換を試み、このベクタ-による形質転換率が高い系統を見出した。2.DNAタギングをエレクトロポレ-ションによる形質転換系を使って行なう系を開発するため、若干のマ-カ-遺伝子(GUS,カナマイシン耐性等)を含む数種のプラスミドを構築した。また、エレクトロポレ-ション実験のため、トマト及びシロイヌナズナのプロトプラスト調整法、培養法を検討し、トマトではエレクトロポレ-ション処理後のプロトプラストの分係を確認した。3.染色体上の特定のDNA配列をin situハイブリダイゼイションで検出する方法を確立するため、プロ-ブとしてシロイヌナズナから大きさ180bpのDNA反復配列をクロ-ニングし、ハイブリダイゼイションの条件を検討した。その結果、このプロ-ブは染色体のセントロメア領域またはその近傍と特異的にハイブリダイズすることを明らかにした。この手法に基き、形質転換体の染色体における外来挿入配列の検出条件の若干の検討を行なった。この手法は現在改良中である。

Research Products

• [Publications] Motoyoshi,F.: "Breeding of tomato lines useful for transformation experiments" 遺伝学雑誌. 66. 760 (1991)
• [Publications] Murata,M.: "Analysis of highly repetitive DNA sequences in Arabidopsis thaliana" 遺伝学雑誌. 66. 761 (1991)
• [Publications] Murata,M.: "Centromeric repetitive sequences in Arabidopsis thaliana" Mol.Gen.Genet.