DNAタギングによる植物遺伝子の効率的なクローニング及びマッピング法の開発

1992 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 03454037
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 本吉 聰男 岡山大学, 資源生物科学研究所, 教授 (90230052)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小倉 豊 岡山大学, 資源生物科学研究所, 助手 (60224193) ; 村田 稔 岡山大学, 資源生物科学研究所, 助教授 (20166292)
• Keywords: DNAタギング / 遺伝子 / クローニング / マッピング / トマト / シロイヌナズナ / 形質転換 / in situハイブリダイゼイション

Research Abstract

DNAタギングによる遺伝子クローニング及びダギングされたDNAのin situハイブリダイゼイションによる染色体へのマッピングの手法を確立するために昨年度に引続き以下の実験を行なった。1.シロイヌナズナでは、形質転換が高頻度で生じるエコタイプWassileskija(WS)を用い、主として根切片とアグロバクテリウムとの共存培養によって、形質転換実験を行なった。TiプラアスミドベクターとしてはpGA482(カナマイシン耐性遺伝子nptIIをT-DNA上に有する)を使用した。これによって約700個以上のカナマイシン耐性個体を再生させ、種子を得た。これらの種子を播いて生じた植物の中には葉色が黄緑色を示すもの、茎葉の形態が異常なものなど若干の変異体が見出された。これらの変異がT-DNAの特定の遺伝子への挿入によって生じたものか否かについて検討中である。2.トマトは葉切片とアグロバクテリウムとの共存培養による形質転換法の改良を行ない、アセトシリンゴン、グリシンベタインなどの共存培養地への添加がカナマイシン耐性カルスの発生率を高めことを見出した。3.DNAタギングによってプロモーターを探索するためのバイナリーベクターの構築を行なった。またサイズの大きなDNAを染色体に挿入するためのベクターも構築した。4.植物染色体に挿入されたT-DNAを検出さするために、プラスミドベクターpGA482の全DNAをビオチンでラべルし、形質転換トマトの根から作成した染色体標本にハイブリダイズさせた。これをFITC-アビジンで検出、さらに坑アビジンで増幅させたところ、染色体上にシグナルが認められた。しかし、バックグラウンドノイズが高いなどの欠点があった。シロイヌナズナでは、染色体が極めて小さいため、まだ検出できていない。10kbサイズのシングルコピーでは、染色体上にマップできることが示された。

Research Products

• [Publications] Motoyosi,F.: "Transfoming activities in backross generations derved from an F1 hybrid between tomato and its wild relative" 遺伝学雑誌. 67. (1992)
• [Publications] Murata,M.: "Alien chromosome segments detected in the TMV-resistant cultivated strains of tomato" 遺伝学雑誌. 67. (1992)
• [Publications] 本吉 總男: "トマトの病害抵抗性の分子遺伝学" 植物組織培養. 9. 149-153 (1992)
• [Publications] 村田 稔: "In situハイブリダイゼイションによる染色体のマッピング" 日本植物病理学会.平成4年度植物感染生理談話会講演要旨. 1-7 (1992)
• [Publications] 本吉 總男: "ToMV抵抗遺伝子Tm-2を含むトマト形質転換実験系作出の試み" 日本植物病理学会報. 59. (1993)