1992 Fiscal Year Annual Research Report
イネYAC(酵母人工染色体)ライブラリーの構築と染色体マッピング
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03454039
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University |
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Principal Investigator |
田中 國介 京都府立大学, 農学部, 教授 (90027194)
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| Keywords | YACライブラリー / イネ / P1ライブラリー / 低融点アガロース / パルスフィールド電気泳動 / キメラ遺伝子形成 / β-アガラーゼ / λファージ |
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| Research Abstract |
平成3年度以降、イネ染色体構造を明らかにする目的でYACライブラリーの構築を進めている。しかしながら、最近キメラ遺伝子の形成が問題化してきたため、平成4年度は挿入断片は小さくなるが、キメラ遺伝子形成の割合が少ないといわれるP1ライブラリーも作成しYACライブラリーの弱点を補足する試みを行った。
イネ幼葉を液体窒素中でホモジナイズし、ナイロンメッシュ(50μm)処理、分画遠心(6,000×g)処理することにより挟雑物を除去した試料を低融点アガロースに埋め込んだ。アガロース包埋の状態でプロテイネースK処理し、その後、アガロース包埋のまま制限酵素MboIでDNAの部分分解処理を行った。その後、パルスフィールド電気泳動(CHEF,170V,15hr,パルスタイム3→50秒)を行い80〜100kb部分を切り出した。β-アガラーゼによりゲルを分解後、P1ベクターpAd10SacBIIをSacI、BamHI切断して作成したアームにライゲーションした。NS3208、NS3210株からPacase、Head/Tailをそれぞれ調製してパッケージングした後、NS3529株にinfectionしkanamycin入り培地上でスクリーニングした。
これまでに、約10,000個のライブラリーを作成した。イネ全ゲノムをカバーするためにはまだ不十分であるが、現在までに得ている手持ちの遺伝子を含むクローンを得ることは比較的簡単であり、現在までに得られているライブラリーをスクリーニングすることにより、イネ遺伝子構造を、これまでのλファージを用いては解析不可能な範囲にわたって解析することが可能となった。なお、現在までに、YACライブラリーで観察されたキメラ遺伝子形成はみられず、YACの弱点を十分にカバーしており、この点も特筆すべき成果と考えている。
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