1993 Fiscal Year Annual Research Report
イネYAC(酵母人工染色体)ライブラリーの構築と染色体マッピング
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03454039
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University |
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Principal Investigator |
田中 國介 京都府立大学, 農学部, 教授 (90027194)
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| Keywords | YACライブラリー / イネ / P1ライブラリー / 貯蔵タンパク質 / プロラミン / パルスフィールド電気泳動 / 染色体 / 重複遺伝子 |
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| Research Abstract |
平成3年度以降イネ染色体構造を明らかにする目的でYACライブラリーの構築を進めている。しかしながら最近キメラ遺伝子の形成が問題化してきたため、平成4年度、平成5年度にかけて挿入断片がやや小型化するものの、キメラ遺伝子形成の割合が少ないP1ライブラリーの構築も進め、YACライブラリーの弱点を補足する試みを行ってきた。
P1ライブラリー構築の手法そのものは昨年度末YACライブラリー構築に用いた方法と基本的に同一である。即ち、イネ幼葉より得た高分子量DNAを制限酵素MboI切断した後、パルスフィールド電気泳動(CHEF 170V、15r、パルスタイム3→50秒)を行い80〜100Kb部分を切り出した。beta-アガラーゼによりゲルを分解後、P1ベクターpAd10sacBIIをSacI、BamHI切断して作成したアームにライゲーションした。Pacase,Head/Tailをそれぞれ調節してパケージングした後NS3529株にinfectionしKanamycin入培地上でスクリーニングした。
2000ケのP1クローンから得られたDNAについて、プロラミン(RM4、PR10、PR16)およびグルテリン(RG21)に対応するプライマーを設計し、Polymerase Chain Reaction(PCR)により挿入配列の増幅を試みた。その結果予定された長さのDNA断片がアガロース電気泳動で確認できた。また、電気泳動にPCR産物をニトロセルローズ膜へブロティングした後、cDNAをプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行った結果、RM4(13kDaプロラミン)、PR10(10kDaプロラミン)についてそれぞれ複数グループについてシグナルが確認できた。この結果、イネプロラミン遺伝子を含む長鎖DNA(90Kb)が得られたことになる。今後、プロラミン遺伝子の遺伝子マッピングや、発現機構を染色体レベルで研究するための足がかりとなる。また、YACライブラリーと対応させるための貴重な材料となる。
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[Publications] Kazunobu Minakuchi: "Cloning and sequence analysis of a cDNA encoding rice glutaredoxin" FEBS Letters. 337. 157-160 (1994)
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[Publications] 田中,國介: "イネ(日本晴)ゲノムPIライブラリーの構築" 京都府立大学 学術報告. 45. 26-33 (1993)
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[Publications] Atsushi Sakamoto: "Cloning and Sequencing Analysis of a Complementary DNA for Manganese-Superoxide Dismutase from Rice(Oryza sativa L.)" Plant Physiol.103. 1477-1478 (1993)
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[Publications] You-Liang Peng: "A Novel Lipoxygenase from Rice;Primary Structure and Specific Expression upon Incompatible Infection with Rice Blast Fungus" The Journal of Biological Chemistry. 269(5). 3755-3761 (1993)
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[Publications] 増村,威宏: "イネ種子貯蔵タンパク質の生合成と集積" 日本醸造協会誌. 88(6). 414-420 (1993)
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[Publications] Takahiro Adachi: "Gene structure and expression of rice seed allergenic proteins belonging to the alpha-amylase/trypsin inhibitor family" Plant Mol.Biol.21. 239-248 (1993)
