中枢ニューロン間シナプス形成・維持の分子機構--in vitroシナプス形成アッセイ系とモノクローナル抗体を用いたアプローチ

1993 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 03454154
• Research Institution: TOKYO METROPOLITAN INSTITUTE FOR NEUROSCIENCES
• Principal Investigator: 黒田 洋一郎 (財)東京都神経科学総合研究所, 神経生化学研究部門, 副参事研究員 (30073084)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小林 和夫 東京都神経科学総合研究所, 神経生化学研究部門, 主事研究員 (80100139) ; 市川 眞澄 東京都神経科学総合研究所, 解剖発生研究部門, 主事研究員 (20124414)
• Keywords: シナプス形成 / 培養ニューロン / アッセイ系 / 細胞内Ca^<2+> / タンパク質リン酸化 / エクト・プロテインキナーゼ / 突起 / 中枢神経系

Research Abstract

ラット18日胚から取った大脳皮質初代培養細胞を7日間培養したものを用い,培養液を捨てた後,[gamma-^<32>P]ATPを入れた反応液を細胞外に加えた。この時,脱リン酸化反応によるラベルされたリン酸のターンオーバーを防ぐためにphosphatase inhibitor calyculin Aを加えた。さらにリン酸化反応の阻害効果を見るためにK-252b添加と無添加群を用意した。このような反応液に替えて,2分半,5分,10分のそれぞれの時間,インキュベートした後,SDSで反応を止め,タンパクを可溶化,電気泳動を行った。このゲルを乾燥後,イメージングプレート(富士フィルム)に一晩程度露光し,イメージングアナライザーBAS2000により解析した。これにより,リン酸化されたバンドのパターン及び,各バンドに取り込まれたラベルの絶対量を得,さらに解析を加えた。
多数のバンドがほぼ3つのグループに分けられた。Ki値を<1muM,1muM,〜2muM,2muM<で区切ると,K-252bに高感受性(Ki<1muM)に分類されるバンドグループは,K-252bによってシナプス形成が阻害される原因となるリン酸化を受けているタンパクの可能性が高いと考えられた。以上のように,リン酸化の見られた各バンドを,リン酸取り込みの初期速度と,K-252bに対する感受性の2点について分類した。このうち,初期速度が速く,K-252bに対する感受性が高いバンドは,エクトプロテインキナーゼの基質となっている可能性が高いと考えられる。

Research Products

• [Publications] Muramoto,K.: "Frequency of synchronous oscillations of neuronal activity increases during development and is correlated to the number of synapses in culture cortical neuron networks" Neuroscience Letters. 163. 163-165 (1993)
• [Publications] Ichikawa,M.: "Formation and maturation of synapses in primary cultures of rat cerebral cortical cells:an electron microscopic study" Neuroscience Research. 16. 95-103 (1993)