1991 Fiscal Year Annual Research Report
遺伝子工学的方法によるプロリルエンドペプチダ-ゼの解媒機構と脳機能への作用解明
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03454493
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
芳本 忠 長崎大学, 薬学部, 助教授 (60088870)
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| Keywords | プロリルエンドペプチダ-ゼ / クロ-ニング / 塩基配列決定 / プロテア-ゼII / 遺伝子組換え |
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| Research Abstract |
1、酵素遺伝子の配列決定:クロ-ニングされたFlavobacteriumのプロリルエンドペプチダ-ゼ遺伝子の塩基配列を明らかにした。まず、酵素遺伝子を含むDNA断片の制限酵素地図を作成した。次いで、制限酵素分解断片をプラスミドpUC18やpUC19に挿入し、これらを用いジデオキシ法で塩基配列を明らかにした。また、必要に応じキロシ-クエンスキットやヌクレア-ゼBal31を用い更に断片化し塩基配列を決定した。得られた塩基配列から本酵素は706個のアミノ酸より成り分子量78,705と推定された。この値はSDSーPAGEでの76,000に近いものである。
2、得られた塩基配列のデ-タ処理:明らかにした酵素遺伝子の塩基配列とそれから推定されるアミノ酸配列について、デ-タベ-スを用いて調べたが、豚脳からのプロリルエンドペプチダ-ゼに34%のホモロジ-が見られた。更に、興味あることに丁度配列決定中であった大腸菌プロテア-ゼII遺伝子とアミノ酸配列で24.5%のホモロジ-が見られた。
3、活性に関与するアミノ酸残基の修飾:Flavobacterium由来のプロリルエンドペプチタ-ゼを〔 ^3H〕DFPにより修飾し、トリプシン分解後,HPLCを用い修飾ペプチド断片を得た。アミノ酸配列の決定により,セリン残基周辺の配列を明らかにした。一方、酵素に特異的な阻害剤、ZーGlyーProCH_2Clによる阻害結果と、類似の酵素との共通配列よりヒスチジン残基の位置を推定した。
4、大腸菌プロテア-ゼII遺伝子のクロ-ニング:ショウットガン法で酵素遺伝子を得、大腸菌をプラスミドpPROIIー12で形質転換すると約90倍に酵素を過剰発現した。酵素遺伝子の塩基配列を明らかにした結果、配列から推定されるアミノ酸配列より酵素の分子量は81,858となり,SDSーPAGEと一致した。配列中、532番目のセリン残基が活性に関与すると推定された。
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Research Products
(9 results)
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[Publications] Yoshimoto Tadashi: "Specific inhibition of dipeptidyl aminopeptidase IV by a new synthetic inhibitor,LーThioprolyl thiazolidine" Agric.Biol.Chem。. 55. 1135-1136 (1991)
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[Publications] Yoshimoto Tadashi: "Structure activith relationship of inhibitors specific for prolyl endopeptidase" Agric.Biol.Chem.,. 55. 37-43 (1991)
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[Publications] Yoshimoto Tadashi: "Cloning and sequencing of the 7zーhydroxysteroid dehydrogenase gene from E.coli and characterization of the expressed enzyme" J.Bacteriol.173. 2173-2179 (1991)
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[Publications] Morikawa Shinーya: "Dye sensitized photooxidation of neutral protease from Bacillus subtilis var.amylosacchariticus:assignment of histidine residue oxidized" Agric.Biol.Chem.,. 55. 2099-2103 (1991)
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[Publications] Tsuji Tatuya: "CPTー11 converting enzyme from rat serum:purification and some prperties" J。PharmacobioーDyn。. 14. 341-349 (1991)
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[Publications] Kanatani Akio: "Protease II from Escherichia coli:sequencing and expression of the enzyme gene and characterizatrion of the expressed enzyme" J。Biohem.110. 315-320 (1991)
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[Publications] Morikawa Shinーya: "Chemical modification of neutral protease from Bacillus subtilis var.amylosacchariticus;assignment of tyrosyl residues iodinated" Agric.Biol.Chem.55. 2751-2756 (1991)
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[Publications] Yoshimoto Tadashi: "Prolyl endopeptidase from Flavobacterium menigosepticum:cloning and sequencing of the enzyme gene" J.Biochem.110. 873-878 (1991)
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[Publications] Kondo Hiroki: "AcetylーCarboxylase from Escherichia coli:gene organization and nucleotide sequence of the biotin carboxylase subunit" Proc.NAti.Acad Sci.USA. 88. 9730-9733 (1991)
