細胞外カルシウムシグナルの細胞内情報伝達機構とその標的(細胞膜カルシウムレセプタ-からカルシウム反応性DNAエレメントまで)

1991 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 03454511
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 尾形 悦郎 東京大学, 医学部(分), 教授 (70013761)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岡崎 具樹 東京大学, 医学部(分), 助手 (60203973) ; 山下 直秀 東京大学, 保健センター, 講師 (90174680) ; 五十嵐 徹也 東京大学, 医学部(分), 講師 (00134601)
• Keywords: PTH遺伝子 / カルシウムレスポンシブエレメント / 細胞外Ca^<2+> / カルシウムレセプタ- / カルシトニン分泌細胞

Research Abstract

1.PTH遺伝子に関する研究:PTH遺伝子上流に存在する2ヶの10数塩基対から成るオリゴヌクレオチド(CaRE)と、各種培養細胞核蛋白との結合様式を検索した。その結果(1)SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で流した核蛋白をニトロセルロ-スフィルタ-にブロットし、一定の結合溶液中でこのCaREと結合させ、CaRE結合蛋白の分子量を調べたところ約90kdと70kdの2本のバンドを見い出した。(2)この結合は蛋白をアルカリ及び酸フォスファタ-ゼ処理すると減弱した。(3)一方培養細胞にCa,Mg,浸透圧低下の刺激を48時間与えた後、その細胞核から得た核蛋白とCaREの結合をゲルシフトアッセイで調べると、いずれの刺激でもCaREと核蛋白の結合は数倍増強した。(4)Hela細胞のλ_<g+11>及びλ_<ZAP>ライブラリ-を用い、(1)の原理を利用してフィルタ-上でのサウスウエスタンブロッティングを行い、現在まで2次スクリ-ニングを終了している。その結果数個のポジティブクロ-ニングを得ることができ、そのクロ-ンの同定を行っているところである。2.カルシウムレセプタ-に関する研究;ラットカルシトニン分泌細胞( ∂MTC)から抽出したpoly(A)+mRNAのシュ-フロ-スグラディエントを行い、各フラクションをゼノパス卵細胞に注入して発現実験を行った。その結果約1.3KのフラクションのmRNA を注入した卵細胞のみ細胞外カルシウム濃度老化に対応して細胞内Ca濃度が上昇した。このmRNAよりλ_<ZAP>IIのベクタ-系でcDNAライブラリ-を作成した。

Research Products

• [Publications] T.Okazaki: "Negative regulatory elements in the human parathyroid hormone gene." J.Biol.Chem.266. 21903-21910 (1991)
• [Publications] T.Okazaki: "Conserved mechanism of negative gene regulation by extracelluar calciumーparathyroid hormone gene versus atrial natriuretic polypeptide gene." J.Clin.Invest.(1992)