B群XP相補性因子の精製並びに抗体作製に基づく機能解析

1992 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 03454553
• Research Institution: KUMAMOTO UNIVERSITY
• Principal Investigator: 山泉 克 熊本大学, 医学部, 教授 (70107093)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 立石 智 熊本大学, 医学部, 助手 (00227109) ; 菅野 辰生 熊本大学, 医学部, 助手 (00211300)
• Keywords: 色素性乾皮症 / DNA修復 / XP相補性因子 / B群XP / C群XP / 無細胞系修復反応

Research Abstract

(1)Weeda等によりクローニングされたXP-B遺伝子より推定されるアミノ酸配列のうちC端側12残基に相当するペプチドを合成し、これをヘモシアニンと化学結合した。このもので家兎を免疫し、得られた抗血清をペプチドカラムで精製した。得られた抗体は免疫に用いたペプチドと特異的に反応することがウエスタンブロットで確認された。この抗体が自然状態のXP-Bタン白と反応するかどうかを確めるため、i)この抗体を正常細胞の核へ注射し、不定期DNA合成(UDS)を抑制するか、ii)XP-B活性を有するHeLa細胞抽出出液と混合し、それをXP-B細胞に注射してXP-B活性が抑制されるかどうかをUDS回復の有無で調ベたが、いずれも陰性であった。自然状態のXP-Bタン白と反応する抗体を確実に得るため、(2)より大きなXP-Bタン白の断片で免疫することを考えた。このためHeLa細胞由来のmRNAより作製したcDNAライブラリを用い、XP-Bタン白N端側約350アミノ酸残基に相当するcDNA断片をPCR法で用いて増巾した。この断片を大腸菌発現ベクターpET23aに組み込み大腸菌を形質転換した。この大腸菌に誘導をかけ、可溶性分画中に融合タン白を得た。このタン白を精製して現在家兎を免疫中である。また最近Legerski等によりXP-C遺伝子がクローニングされcDNAの塩基配列が明らかになった。そこでXP-Bタン白で用いた方法で、XP-Cタン白のN端側的約330アミノ酸残基に相当するタン白を大腸菌で大量発現させ、これを精製して家兎を免疫している。これらの家兎からXP-B、XP-Cタン白と反応する抗体が得られれば、これら2種のタン白がヒト細胞内で複合体を形成しているかどうかが、免疫沈降法等を用いて解明されるものと考えられる。

Research Products

• [Publications] Satoshi Tateishi: "Human nucleotlde excision nuclease in cises synthetic double-stranded DNA containing a pyrimidine dimer at the fourth phosphodiester linkage3' to the pyrimidine dimer" Biochemistry. 32. 1541-1547 (1993)
• [Publications] Masaru Yamaizumi: "Protein factors involved in repair of uv-induced DNA lesions in human cells" Alfred Benzon Symposium 35. 35. (1993)