ミトコンドリア呼吸系の複合体IIIおよび複合体Iの結晶化とX線結晶解析

1991 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 03454565
• Research Institution: Himeji Institute of Technology
• Principal Investigator: 吉川 信也 姫路工業大学, 理学部, 教授 (40068119)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 月原 冨武 徳島大学, 工学部, 教授 (00032277) ; 伊藤 恭子 姫路工業大学, 理学部, 助手 (70206316)
• Keywords: チトクロムbC_1,複合体 / 複合体I / 膜タンパク質 / 結晶構造解析

Research Abstract

本年度は複合体IIIの結晶化条件の検討に重点を置いた。まずRieskeの方法を基本として精製条件をさらに検討し、再現性の高い高収量な(500mg/ウシ心筋 800g)精製法を確立した。次にこの標品を用いて結晶化条件を検討し、界面活性剤シュ-クロ-スモノラウレ-ト存在下で沈澱剤として、ポリエチレングリコ-ルを用いて結晶化することに成功した。
この結晶標品は、既に報告されているものと同等の電子伝達活性、吸収スペクトル、ポリペプチド組成を示した。しかし、吸収スペクトルの分子吸光係数を原子吸光分析によって詳細を検討したところ、その値はこれまでに報告されているより約30%大きかった。ComplexIVの場合と同様に、結晶化によってのみ除去できる鉄原子が存在することを示している。
このことはまた、結晶化は巨大な膜タンパク質複合体の精製法として最適であることも示唆している。これまで2種類の結晶系の結晶が得られている。一方は双晶であるため構造解析には不適当であったが、他方の六方晶系の結晶からは単結晶のX線回折が得られた。分解能は6.7Åであった。現在、Native結晶の回折強度デ-タの収集を続けている。
なお、ComplexIII,ComplexIV(チトクロム酸化酵素)ともに、ウシ心筋から精製された酵素は結晶化されたが、多くの研究者の努力にもかかわらず、サブユニット組成の単純な細菌(パラコッカス)の酵素は結晶化されていない。このことは後者は結晶中での親水性の相互作用が弱いため、結晶化が因難(あるいは結晶が不安定)であるためであることを示唆している。したがって少なくとも膜貫通型酵素については大きな酵素の方が結晶化が容易であると言える。
複合体Iの精製条件の検討はHatefiの方法を基本として行っているが、分子量が大きすぎるためか容易ではなく、まだ完全な再現性は得られていない。

Research Products

• [Publications] S.Yoshikawa: "Strategies for crystallization of membrane protein complexes." J.Cryst.Growth.
• [Publications] T.Kubota: "Crystallization and preliminary Xーray crystallographic studies of bovine heart mitochondrial cytochrome bc_1 complex." J.Mol.Biol.221. 379-382 (1991)