共焦点系による培養細胞・切片内サイクリックヌクレオチドの三次元測定方法の確立

1991 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 03557034
• Research Institution: The Open University of Japan
• Principal Investigator: 鬼頭 昭三 放送大学, 教養学部, 教授 (00010140)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 三好 理絵 東京女子医科大学, 助手 (80209965) ; 野本 照子 東京女子医科大学, 教授 (20075154)
• Keywords: 培養神経細胞 / cyclic AMP / catalytic unit / regulatory unit / rhodamine / fluorescein

Research Abstract

培養神経細胞について蛍光法によってcyclic AMPを測定するためには、protein kinase Aのcatalytic unitとregulatory unitを用意し、それぞれをfluoresceinとrhodamineでラベルする必要がある。catalytic unitについては、国内研究者による供与を受けたので、catalytic unitをfluoresceinにラベルし、それを精製する作業を行った。一方、regulatory unitについては、市販のholoenzymeを用いて、これをcatalytic unitとregulatory unitに分け、後者を精製する作業を行ってきた。さらに海馬培養神経細胞内にfluoresceinをラベルしたcatalytic unitを微量注入する予備実験を継続中である。
尚、本年度は蛍光顕微鏡装置にモ-タ-駆動フォ-カスコントロ-ラ-、DM切換装置を併設したので培養細胞を用いてfluorometryを行い、蛍光像の三次元的観察のための実験をした。
また、cyclic AMPと細胞内カルシウムイオンとが用量的及び時間的に平行的に動く系を選び、カルシウムイオンを測定することにより、cyclic AMPの動きを把握する実験を行っている。具体的には、アメフラシの感覚神経にセロトニンを加えることにより、cyclic AMPが上昇し、アデニ-ルシクラ-ゼ活性化に伴って、Sタイプカリウムチャンネルがリン酸化を受ける。その結果、細胞内カルシウムイオンが上昇することが知られている。この系を用いて、セロトニン刺激後の細胞内カルシウム濃度をfura-2 fluorometryにより測定することにより、cyclic AMPとの関係を検索することを目的として実験を継続中である。

Research Products

• [Publications] Miyoshi,R.,Kito,S.,Nomoto,T.,Doudou,N.: "Influence of age on N-methyl-D-aspartate antagonist binding site in the rat brain studied by in vitro autoradiography" SYNAPSE. 8/3. 212-217 (1991)
• [Publications] Miyoshi,R.,Kito,S.,Doudou,N.,Nomoto,T.: "Effect of age on α-amino-3-hydroxy-5 methylisoxazole-4-propionic acid (AMPA) binding sites in the rat brain studied by in vitro autoradiography" Neurochem.Res.,. 16. 848-854 (1991)
• [Publications] Miyoshi,R.,Kito,S.,Tanaka,A.: "Effect of neurotensin on dopamine and muscarinic acetylcholine receptors in the rat striatum" Basal Ganglia III、27. 39. 371-378 (1992)
• [Publications] Yoneda,Y.,Ogita,K.,Emoto,R.,Suzuki,T.,Kito,S.: "Identification and characterization of specific binding site of [ ^3ll]spermidine in synaptic membranes of rat brain" Brain Research. 563. 17-27 (1991)
• [Publications] Miyoshi,R.,Kito,S.,Nomoto,T.,: "Cholecystokinin increases intracellular Ca^<2+> concentration in cultured striatal neurons" Neuropeptides. 18. 115-119 (1991)
• [Publications] Miyoshi,R.,Kito,S.,Nomoto,T.,Weiser,M.,Joh,T.: "Effect of caerulein on expression of the immediate early genes c-fos and zif/268 in the rat brain" Neuroscience Letter.
• [Publications] Kito,S.,Miyoshi,R.,Nomoto,T.: "NMDA Receptor Related Agents" NPP Books, 414 (1991)
• [Publications] Kito,S.,Miyoshi,R.: "Neurotransmitter Receptors :Neuroreceptor Mechanism in Brain" Plenum Press, 495 (1991)