1992 Fiscal Year Annual Research Report
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03557110
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
竹内 利行 群馬大学, 内分泌研究所・化学構造部門, 教授 (00109977)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山内 広世 旭化成工業(株)医薬開発センター, 副部長
小島 至 群馬大学, 内分泌研究所・薬学部門, 教授 (60143492)
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| Keywords | カルシトニン / 生理活性ペプチド / 限定切断 / 細胞医薬 |
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| Research Abstract |
カルシトニン(CT)は甲状腺C細胞で前駆体として産生され、限定切断反応とアミド化反応をうけて生理活性型CTとなる。これらの反応は内分泌細胞に特徴的で、皮膚細胞,筋肉細胞,リンパ球のような非内分泌細胞ではおこらない。我々は生理活性型CTを適度に分泌する“細胞医薬"を非内分泌細胞を用いて作る目的で、CT遺伝子を上記のような細胞で発現させることを試みている。初年度は、ヒトCT前駆体cDNA中の生理活性CTに相等するDNA部分を、ヒトより50倍生理活性が強いサケCT DNAに置き換えた。次にCT前駆体が非内分泌細胞で限定切断反応をうけるために、サケCT部分の両端が4つの塩基性アミノ酸配列をもつようにDNAに点変異を導入した。2年度は限定切断反応の効率を上げるため、CTのカルボキシル端に伸びるペプチド部分をDNA配列から切除した。更にCTのアミノ端の切断部位も-1位から-4位の塩基性アミノ酸に加えて-6位にもアルギニン基を加え、切断効率の向上をはかった。この変異CT DNAを導入した非内分泌細胞はカルボキシル端にグリシンが付加したCTを産生できるが。しかしCTが生理活性をもつためには更にグリシンがアミド化反応をうける必要がある。そこでアミド化酵素cDNAをラット脳cDNAライブラリーよりクローニングし、全配列をCT DNAとともに動物細胞発現ベクターに組み込んだ。モンキー腎上皮由来COS-7細胞にこのDNA導入すると、細胞培養液中にラジオイムノアッセイでCT免疫活性を検出した。しかし、アッセイに用いた抗体がCTのどの部分と反応するのか不明なので、2年度にCTのアミド部分に反応する抗体、及びグリシンが付加したCTに反応する抗体を作製した。3年度はこれらの抗体を用いて、NHI3T3,CHO,COS等の非内分泌細胞で産生されたCTの分子的性状が生理活性型になっているかどうかを検討する。又、培養細胞株のみならず、皮膚の初代培養細胞でもCT発現を検討する予定である。
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[Publications] Yanagita M,Nakayama K,Takeuchi T,: "Processing of mutated proinsulin with tetrabasic cleavage sites to bioactive insulin in the non-endocrine cell line,COS-7" FEBS Letters. 311. 55-59 (1992)
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[Publications] Dickinson C.J,Takeuchi T,et.al.: "Expression and processing of prohormones in non-endocrine cells" American Journal of Physiology. (1993)
