固定化ルシフェラ-ゼを用いる生物発光検出器の開発と分析化学的応用

1991 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 03650608
• Research Institution: Osaka Prefecture University
• Principal Investigator: 和佐 保 大阪府立大学, 工学部, 教授 (10081308)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 安部 巌 大阪府立大学, 工学部, 助手 (60081311) ; 八尾 俊男 大阪府立大学, 工学部, 講師 (50081310)
• Keywords: 生物発光検出器 / 固定化ルシフェラ-ゼ発光素子 / ホトダイオ-ド発光検出器 / 乳酸脱水素酵素活性 / 基質分析

Research Abstract

固定化酵素膜を発光素子とする化学・生物発光流液検出器の開発を行い、下記の研究成果を得た。
1.生物発光検出器の開発と分析化学的応用:
(1)細菌起源ルシフェラ-ゼはポリアリルアミン修飾ナイロンシ-ト上にGA架橋法で固定化する方法が最良の感度と長期安定性(約1ヶ月)を示し、NADHのFIA応答の検量範囲は2〜25000pmolであった。血清中のLDH活性の測定(10〜1000IU/1)及びLDH(ADH)リアクタ-を併用する生体試料中の乳酸(エタノ-ル)の定量(0.01〜10mM)に応用し、NADH応答型流液検出器としての有用性を明らかにした。
(2)蛍起源ルシフェラ-ゼのポリアリルアミン修飾ナイロンシ-ト及び市販担体(Immunodyne)への固定化について比較検討を実施中である。現時点では長期安定性の良否は明確でないが、本研究で開発したナイロンシ-トの方が高感度を示し、ATPのFIA応答の直線範囲は1〜1000pmolであった。今後、固定化方法及ぴ流液系を最適化することにより一層の検出感度の向上が期待できる。
2.POD/BSA/GA共重合膜を発光素子とするルミノ-ル化学発光検出器は過酸化水素に対して5〜2000pmolの範囲で良好な直線関係を示した。また、GODリアクタ-と透折器を組み合わせた検出システムはタンパク質の妨害を排除でき、グルコ-スに対する検量範囲は0.1〜1000nmolであった。血清、ジュ-スなどについの本法によるグルコ-ス分析の結果は比色法と良好な相関関係を示した。
3.ホトダイオ-ドとPOD発光素子を組み合せた流液発光検出器を試作し、ルミノ-ル発光系について過酸化水素のFIA応答特性を検討した(検量範囲0.5〜100nmol)。現在、光チョッパ-を用いる交流増幅を検討中。

Research Products

• [Publications] 八尾 俊男: "Highly Sensitive Amperometric Detection of Nicotineamide Coenzymes by Use of an Immobilized Enzyme Reactor Involving Amplification by Substrate Recycling" Analytica Chimica Acta. 248. 345-349 (1991)
• [Publications] 八尾 俊男: "Highly Sensitive Determination of LーLactate and Pyruvate by Liquid Chromatography and Amperometric Detection with Lactate OxidaseーLactate Dehydrogenase Coimmobilized Reactor Involving Amplification by Substrate Recycling" Electroanalysis. 3. 493-497 (1991)
• [Publications] 安部 巌: "Solvent Extraction of Amino Acids for the PreーTreatment of GC AnalysisーFundamental Investigation in Quntitative Analysisー" Chemistry Express. 6. 101-104 (1991)
• [Publications] 安部 巌: "Solvent Extration of Amino Acids for the PreーTreatment of GC AnalysisーImprovement in Extraction Efficiencyー" Chemistry Express. 6. 253-256 (1991)
• [Publications] 和佐 保: "固定化酵素膜を用いる化学・生物発光検出器の開発と分析化学的応用" 分析化学.