グルタチオン合成酵素の生理活性ペプチド合成反応への応用

1991 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 03660138
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 小田 順一 京都大学, 化学研究所, 教授 (50027041)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 田中 琢治 京都大学, 化学研究所, 教務職員 (40227145) ; 加藤 博章 京都大学, 化学研究所, 助手 (90204487)
• Keywords: グルタチオン合成酵素 / タンパク質工学 / ペプチド合成 / 部位特異的変異導入 / 基質認識

Research Abstract

これまでのグルタチオン合成酵素・基質複合体の結晶構造解析では、γーグルタミルシステインとグリシンの結合位置を同定するにはいたっていない。そこで、γーグルタミルシステイン結合部位近傍に存在し、相互作用することが予想される残基、Lys18,Arg86,Arg210,Asn283,Glu292,Ser286,Thr288をそれぞれ部位特異的変異導入法を用いて他の各種アミノ酸残基に変換し、得られた変異型酵素の性質を調べるとともに基質アナログとの反応性から基質認識機構の詳細を解析した。また、活性中心の極く近傍に存在するフレキシブルル-プ構造の改変が、グリシンの結合に対して影響を与えることが判明したため、ル-プ欠損型酵素を作成しグリシンに対する基質特異性を変換することを試みた。
その結果、γーグルタミルシステインについては、Arg86がグルタミン酸部分のカルボキシル基と相互作用し、Arg210がシステイン部分のカルボキシル基と相互作用していることが見いだされた。また、Thr288の側鎖はシステイン部分のチオ-ル基と相互作用としてることも示された。現在こられの結果を基に設計した基質アナログを合成するとともに、得られた変異型酵素による新たなペプチド合成反応を検討中である。
一方、フレキシブルル-プの除去は、グリシンに対する認識能を低下させ、ル-プ欠損型酵素は、ATPとγーグルタミルシステインとの反応で生じた反応中間体を水と反応させるATP加水分解活性を示すようになった。この基質特異性の低下は、グリシン以外のアミノ酸を基質として用いうる可能性を示唆していることから、他の変異導入と組み合わせるとともに、グリシン以外の基質認識能を有する変異型酵素のスクリ-ニングを検討している。

Research Products

• [Publications] 田中 琢治: "Mutational and Proteolytic Studies on a Flexible Loop in Glutathione Synthetase from Escherichia coli B:The Loop and Arginine 233 Are Crifioal for the Catalytic Reaction" Biochemistry. 31. 2259-2265 (1992)
• [Publications] 杉山 明生: "Overexpression and Purification of Asparagine Synthetase from Escherichia coli" Bioscience Biotechnology and Biochemistry. 56. 376-379 (1992)
• [Publications] 山口 宏: "Structural Studies on Glutathione Synthetase from Escherichia coli B" Photon Factory Activity Report. 9. (1992)
• [Publications] 加藤 博章: "CN結合酵素系の構造に関する最近の進歩" 日本農芸化学会誌. 65. 1786-1790 (1991)
• [Publications] 加藤 博章: "Loop構造:酵素における新しい機能性構造単位" バイオサイエンスとインダストリ-. 49. 844-848 (1992)
• [Publications] 加藤 博章: "グルタチオン合成酵素の結晶構造に基づく活性中心構造の特徴と機能について" 生化学. 64. (1992)
• [Publications] 大野 惇吉: "実験化学講座27生物有機" 丸善株式会社, 474 (1991)