1992 Fiscal Year Annual Research Report

グルタチオン合成酵素の生理活性ペプチド合成反応への応用

Research Project

Project/Area Number	03660138
Research Institution	KYOTO UNIVERSITY
Principal Investigator	小田順一京都大学, 化学研究所, 教授 (50027041)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	田中琢治京都大学, 化学研究所, 助手 (40227145) 加藤博章京都大学, 化学研究所, 助手 (90204487)
Keywords	グルタチオン合成酵素 / タンパク質工学 / ペプチド合成 / 部位特異的変異導入 / 基質認識
Research Abstract	これまでに、グルタチオン合成酵素・基質複合体の結晶構造解析を行ってきたが、基質結合部位の詳細を明らかにするにはいたっていない。推定されたγ-グルタミルシステイン結合部位近傍に存在し、相互作用をすることが予想される残基、Lys18,Arg86,Arg210,Asn283,Ser286,Thr288,Glu292をそれぞれ部位特異的変異導入法を用いて他の各種アミノ酸に変換し、その諸性質を解析することによって、γ-グルタミルシステインはArg86とArg210の間に存在し、Thr288によってシステイン部分が認識されることが判明した。 Adenosine(5´)polyphospho(5´)pyridoxalを用いたAffinity Labelingの結果、修飾される残基は結晶構造解析によって示されたATPの結合部位近傍に全て存在すること、修飾試薬との複合体酵素の結晶解析によって示された修飾試薬の結合部位がATPの結合部位と一致することから、ATPの結合部位が決定された。活性部位の近傍に位置するフレキシブルループはその位置から酵素活性に関与することが示唆されている。このループ構造上のPro227,Gly229,Arg233,Gly240,Arg241の変異やループ構造の除去などにより作製した変異型酵素の解析から、ループ構造は酵素活性に必須であることが判明した。すなわち、γ-グルタミルシステインがATPによって活性化された不安定な反応中間体の加水分解を防ぐと共に、水分子との識別を含めたグリシンの基質特異性の制御、基質の結合部位における配向性を反応に都合のよい形にすることで基質の反応性を向上させることに関与していることが判明した。これらの結果から、ループ構造の改変やγ-グルタミルシステインの結合部位の改変により基質としてγ-グルタミルシステインやグリシン以外のペプチド、アミノ酸を高い効率でとり込むことのできる変異型酵素が作製できると考えられ、ペプチド合成への応用が期待できる。

Research Products
(5 results)

All Other

All Publications (5 results)

[Publications] 日妾隆雄: "Use of adenosine(5´)polyphospho(5´)pyridoxals to study the substrate-binding region of glutathione synthetase from Escherichia coli B" Biochemistry. 32. 1548-1554 (1993)
[Publications] 山口宏: "Three-dimensional structure of glutathione synthetase from Escherichia coli B at 2.0A^^○ resolusion" Journal of Molecular Biology. (1993)
[Publications] 田中琢治: "Mutational and proteolytic studies on a flexible loop in glutathione synthetase from Escherichia coli B:The loop and arginine-233 are critical for the catalytic reaction" Biochemistry. 31. 2259-2265 (1992)
[Publications] 西岡孝明: "Three-dimensional structure of ternary complex of glutathione synthetase from Escherichia coli B with ADP and glutathione" Photor Factory Activity Report.10. (1992)
[Publications] 加藤博幸: "グルタチオン合成酵素の結晶構造に基づく活性中心構造の特徴と機能について" 生化学. 64. 181-186 (1992)

1992 Fiscal Year Annual Research Report

グルタチオン合成酵素の生理活性ペプチド合成反応への応用

Principal Investigator

小田 順一 京都大学, 化学研究所, 教授 (50027041)

Research Products

[Publications] 日妾 隆雄: "Use of adenosine(5´)polyphospho(5´)pyridoxals to study the substrate-binding region of glutathione synthetase from Escherichia coli B" Biochemistry. 32. 1548-1554 (1993)

[Publications] 山口 宏: "Three-dimensional structure of glutathione synthetase from Escherichia coli B at 2.0A^^○ resolusion" Journal of Molecular Biology. (1993)

[Publications] 田中 琢治: "Mutational and proteolytic studies on a flexible loop in glutathione synthetase from Escherichia coli B:The loop and arginine-233 are critical for the catalytic reaction" Biochemistry. 31. 2259-2265 (1992)

[Publications] 西岡 孝明: "Three-dimensional structure of ternary complex of glutathione synthetase from Escherichia coli B with ADP and glutathione" Photor Factory Activity Report.10. (1992)

[Publications] 加藤 博幸: "グルタチオン合成酵素の結晶構造に基づく活性中心構造の特徴と機能について" 生化学. 64. 181-186 (1992)

小田順一京都大学, 化学研究所, 教授 (50027041)

[Publications] 日妾隆雄: "Use of adenosine(5´)polyphospho(5´)pyridoxals to study the substrate-binding region of glutathione synthetase from Escherichia coli B" Biochemistry. 32. 1548-1554 (1993)

[Publications] 山口宏: "Three-dimensional structure of glutathione synthetase from Escherichia coli B at 2.0A^^○ resolusion" Journal of Molecular Biology. (1993)

[Publications] 田中琢治: "Mutational and proteolytic studies on a flexible loop in glutathione synthetase from Escherichia coli B:The loop and arginine-233 are critical for the catalytic reaction" Biochemistry. 31. 2259-2265 (1992)

[Publications] 西岡孝明: "Three-dimensional structure of ternary complex of glutathione synthetase from Escherichia coli B with ADP and glutathione" Photor Factory Activity Report.10. (1992)

[Publications] 加藤博幸: "グルタチオン合成酵素の結晶構造に基づく活性中心構造の特徴と機能について" 生化学. 64. 181-186 (1992)