ポリメラ-ゼ連鎖反応に基づく豚流行性肺炎マイコプラズマの遺伝学的解析とその応用

1991 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 03660305
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 原澤 亮 東京大学, 医学部・(医), 助教授 (70159101)
• Keywords: マイコプラズマ / ポリメラ-ゼ連鎖反応 / PCR

Research Abstract

豚の流行性肺炎は,発育の遅延および飼料効率の低下などに基づく経済的な損失をもたらすため,マイコプラズマを原因とする家畜疾病の中でも,最も警戒を要するものの一つとされている。本病は世界各地の養豚場で発生が知られており,わが国における近年の発生率は60%以上と報告されている。一般にマイコプラズマは人工培地に発育可能な最小の原核生物であり,そのゲノムサイズは約80万塩基対と小さいことが知られている。しかし,本病の原因となるMycoplasma hyopneumoniaeは培養が極めて困難であり,通常の培地を用いての初代分離は一般に成功しない。このため,本マイコプラズマの生物学的および遺伝学的性状に関する知見ははなはだ乏しく,その病原因子に関する研究は著しく立ち遅れており,本菌による病理発生機序も明らかでなく,また本病の予防法も確立されていない。本年度は,はじめにポリメラ-ゼ連鎖反応(PCR)を利用することにより,マイコプラズマの大量培養を行うことなく,そのゲノムDNAを大量に試験管内合成させるための条件を整備した。このため,M.hyopoeumoniae DNAのゲノムライブラリ-の中からサザンブロッ交雑法により選択された,反復配列を含むクロ-ンについて,その塩基配列をサンガ-法により決定した。決定された反復配列は,本マイコプラズマのゲノム内に少なくとも8コピ-存在することがDNA交雑法により確認された。そこで,この領域を標的としたPCR法を開発することにした。その結果,この増復配列をはさむ約20塩基からなる合成プライマ-を用いることにより,本マイコプラズマを特異的に検出することが可能となり,その感度は10^2CFUの菌数を検出できるものであった。さらに,現在では,改良された二段階PCR法を用いることにより,10CFUの菌数が検出できるまでに至っている。これは,本病の診断が感染初期に行える途を拓くものである。

Research Products

• [Publications] Harasawa,R.,Koshimizu,K.,Takeda,O.,Uemori,T.,Asoda,K.,and Kato,I.: "Detection of Mycoplasma hyopneumoniae DNA by the polymerase chain reaction." Molecular and Cellular Probes. 5. 103-109 (1991)
• [Publications] Harasawa,R.,Dybvig,K.,Watson,H.L.and Cassell,G.H.: "Two geromic clusters amorg 14 serovars of Ureaplasma urealyticum." Systematic and Applied Microbiology. 14. 393-396 (1991)
• [Publications] Yoshida,T.,Harasawa,R.,and Goto,T.: "Translation of doubleーstranded RNA segments 1 and 2 of chuzan virus in rabbit reticulocyte lysate." Journal of Veterinary Medicine,series B.38. 630-634 (1991)
• [Publications] 原澤 亮,志賀 淳治,阿部 賢治: "PCR法の基礎と応用。" ビフィズス. 4. 141-144 (1991)
• [Publications] 原澤 亮 水澤 博: "PCR法によるマイコプラズマ汚染の検出" 実験医学. 9. 95-99 (1991)
• [Publications] Harasawa,R.,Uemori,T.,Asada,K.,and Kato,I.: "'BoxA'like seguence between the 16S/23S spacer in rRNA operon of mycoplasmas." FEBS Letters. 297. 1-3 (1992)