生体高分子のポリアミン作用部位を探索するための方法論の開発

1993 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 03671029
• Research Institution: JOSAI UNIVERSITY
• Principal Investigator: 鮫島 啓二郎 城西大学, 薬学部, 教授 (00072413)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 白幡 晶 城西大学, 薬学部, 講師 (50150107)
• Keywords: スペルミジン合成酵素 / 活性部位構造 / 脱炭酸化S-アデノシルメチオニン / ジアステレオマーの分離 / HTC細胞 / 細胞の増殖 / ポリアミンアナログ / スペルミジン

Research Abstract

研究計画に記した課題1〜4のうち、課題2,3については前年度から新たな進展がなく、課題1,4について記す。課題1:スペルミジン合成酵素の活性部位構造の解明に関する研究一本酵素の活性部位に触媒反応を行うために重要なスルフヒドリル基が存在することは、各種SH試薬を用いる失活反応から想定されていた。そこで、さらに明らかな証拠を得るために、市販のスルフヒドリル基標識用蛍光試薬IAEDANSを用い精製酵素の標識を試みるところ、基質のプトレシン共存下または何も加えない場合、明瞭な蛍光標識酵素が認められた。一方、基質の脱炭酸化S-アデノシルメチオニン(deAdoMet)共存下で反応させると、蛍光標識酵素の生成は極端に阻止された。この結果はIAEDANSが本酵素の活性部位構造を究明するために有用である可能性を示した。目下、ラット由来本酵素のアミノ酸配列を決定中である。本研究に関連して、化学合成したseAdoMetジアステレオマーを誘導体にすることなく、逆相系のイオンペアHPLCで分離することに初めて成功した。分取したS,R異性体についてのラセミ化速度などのデータも得ることができた。課題4:スペルミジンの過剰蓄積による細胞死-オルニチン脱炭酸酵素阻害剤を用いてポリアミン欠乏状態にしたHTC細胞に、ポリアミンアナログを添加して得られた現象から、細胞増殖には微量スペルミジンが必須であり、それがハイプシン合成に関連した問題であるという間接証拠を前年度までに得てきた。今年度は、アナログの代わりにスペルミジンを添加したときに観察される増殖開始の遅れの現象に着目してその原因を追求した。遅れの現象が、培地中のアミンオキシダーゼ活性を阻害するために加えるアミノアニジン共存下、添加するスペルミジン量により細胞死にまで至ことがわかり、諸種実験の結果、それがスペルミジンの過剰蓄積による細胞死であることを明らかにした。

Research Products

• [Publications] Shirahata,A.,Takahashi,N.,Beppu,T.,Hosoda,H.,Samejima,K.: "Effect of inhibitors of spermidine synthase and spermine synthase on polyamine synthesis in rat tissues" Biochemical Pharmacology. 45. 1897-1903 (1993)
• [Publications] Basu,H.S.,Pellarin,M.,Feuer-stein,B.G.,Shirahata,A.,Same-Jima,K.,Deen,D,F.,Marto,L.J.: "Interaction of a polyamine analogue,1,19-bis(Ethylamino)-5,10,15-triaza-nonadecane(BE-4-4-4-4),with DNA and effect on growth,survival,and polyamine levels in seven human brain tumorcell lines" Cancer Research. 53. 3948-3955 (1993)