細胞分化に伴う細胞増殖必須遣伝子(ヒトTS遣伝子)の発現調節に関する研究

1991 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 03671059
• Research Institution: University of Shizuoka
• Principal Investigator: 竹石 桂一 静岡県立大学, 食品栄養科学部, 教授 (90012608)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 堀江 信之 静岡県立大学, 食品栄養科学部, 助手 (70209287)
• Keywords: チミジル酸合成酵素 / ヒト遣伝子 / 細胞増殖必須遣伝子 / 細胞分化 / 核内因子 / DNA結合蛋白質

Research Abstract

我々はヒトチミジル酸合成酵素(TS)遣伝子の5'上流域に結合し、ヒト前骨髄性白血病細胞(HLー60細胞)の分化に伴って変動する2つの蛋白質性内因子(NFーTS2,NFーTS3)をすでに見出している。
本研究においては、まず、それら2つの核内因子の細胞周期に伴う変動を調べたところ、NFーTS2がG_0期からG_1期への移行の過程で新たに出現することを見出した。続いて、これまでのメチレ-ション結合阻害実験に加えて、さらにTS cDNAの5'欠失DNA断片を利用したゲルシフトアッセイや合成DNA断片を利用したDNA一蛋白質複合体形成の競合実験を行い、その結果から、2つの核内因子のヒトTS遣伝子上の結合部位はいずれも翻訳開始コドンATGの近傍であることを確定した。それら因子の生化学的性質についても2、3調べた。
次に、これらの因子の機能を探るため、ヒトTS遣伝子のプロモ-タ-領域を含むが核内因子の結合部位を欠失させたDNA断片と、欠失させていない断片とを用いてCAT(クロラムフェニコ-ルアセチルトランスフェラ-ゼ)アッセイを行なった。その結果、NFーTS2は遣伝子発現に対し促進的に作用するのに対し、NFーTS3は抑制的に作用することが示唆された。現在、さらに詳細に検討中である。
次に、核内因子NFーTS2を比較的多量含むことを確認しているHeLa細胞から大量に核抽出液を調製し、その精製を試みた。先ず、その核抽出液を硫安分画したところ、非特異的なDNA結合蛋白質とNFーTS2とを分離することができた。ゲルろ過とイオン交換のクロマトグラフィ-による精製を試みたが、NFーTS2の結合活性を検出することは出来なかった。NFーTS2は複数の因子からなるか、あるいはかなり不安定な因子である可能性が高い。現在、DNAアフィニティクロマトグラフィ-による精製を検討している。

Research Products

• [Publications] Sumiko Kaneda: "Promoterーspecific regulatory sequences in the human thymiーdylate synthase gene clustered at the 5'ーend of the first intron" J.Biol.Chem.
• [Publications] Nobuyuki Horie: "Identification of cellular differentiationーdependent nuclear factors that bind to a human gene for thymidylate synthase" Biochem.Biophys.Res.Commun.
• [Publications] Nobuyuki Horie: "Characterization of DNAーbinding nuclear factors that bind to the human thymidylate synthase gene" J.Biol.Chem.