ヒトピルビン酸脱水素酵素遺伝子の発現調節とPCR法による病態解析

1992 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 03680174
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 小池 吉子 長崎大学, 医学部, 助教授 (80039619)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 後藤 信治 長崎大学, 医学部, 助手 (50186889) ; 浦田 芳重 長崎大学, 医学部, 助手 (30185087)
• Keywords: ピルビン酸脱水素酵素 / α,βサブユニット / 遺伝子 / 発現調節 / 欠損症 / PCR増幅 / 点変異

Research Abstract

ヒトピルビン酸脱水素酵素(PDH)は、解糖並びにアミノ酸代謝上の重要中間体であるピルビン酸の酸化的脱炭酸反応を触媒するピルビン酸脱水素酵素複合体の成分酵素の一つで、その初発不可逆的脱炭酸反応を担っている代表的チアミンピロリン酸(TPP)酵素である。異種のサブユニットα(PDHα,41kDa)およびβ(PDHβ、36kDa)の四量体(α_2β_2、153kDa)構造を保持している。最近、両サブユニットのcDNAをクローン化し、その全塩基配列とアミノ酸配列を決定し、更に両サブユニット核遺伝子のクローン化にも成功し、その全塩基配列決定も遂行した。近年、慢性酸血症を伴い脳、神経、運動障害を主症状とする先天性代謝異常症という難病の病因の一つが本酵素欠損症であることが判明し、その出生前診断と治療法の確立が急がれている。本研究では、PDHαおよびβゲノムDNAの5'端領域(プロモーター領域)を適切な発現ベクターに組み込み、発現機構および調節因子の究明と両ゲノムDNAの全エクソン領域をPCR法で増幅し、その配列決定法を確立した後、PDH欠損症ゲノムDNAの単離、エクソン増幅、塩基配列解析により変異部位を探索し、発症要因の本態解明とを実施した。先ず、両遺伝子5'端上流域を用いてCATアッセイおよびフットプリント法での発現因子解析と調節機構解明を継続中である。私共が確定診断した8例のPDH欠損症例中、生後3日で死亡した症例の病理解剖肝よりゲノムDNAを単離出来た。更に両ゲノムDNAの全エクソンをPCR法で増幅出来るオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、増幅法を確立した後、欠損症DNAの両ゲノムDNAエクソン増幅、塩基配列決定を行い、PDHαゲノムDNAのエクソン5と6とにそれぞれ1ケ所の塩基置換を検出した。これらの点変異と両サブユニットタンパク質の欠失との関連性を考察した。更に症例解析を推進している。

Research Products

• [Publications] Yoshishige Urata: "Novel separation and amino acid sequence of α and β subunits of pig heart pyruvate dehydrogenase" Journal of Nutritional Science and Vitaminology. 37. 257-267 (1991)
• [Publications] Masahiko Koike: "Primary structures of pig pyruvate dehydrogenase α and β subunits" Biochemistry and Physiology of Thiamin Diphosphate Enzymes. 184-191 (1991)
• [Publications] Kichiko Koike: "Characterization of human pyruvate dehydrogenase α and β subunit genes" Biochemistry and Physiology of Thiamin Diphosphate Enzymes. 192-199 (1991)
• [Publications] Kichiko Koike: "Proteinase-catalysed activation of porcine heart muscle pyruvate dehydrogenase and identification of its cleavage site" Biochimica et Biophysica Acta. 1118. 223-230 (1992)
• [Publications] Kichiko Koike: "Cloning and nucleotide sequence of the cDNA encoding human 2-oxoglutarate dehydrogenase" Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 89. 1963-1967 (1992)
• [Publications] Kichiko Koike: "Molecular genetic aspects of human pyruvate dehydrogenase and its defect" Proceeding of the 1st International Congress on Vitamins and Biofactors in Life Science in Kobe 1991. 397-400 (1992)
• [Publications] 小池 吉子: "チアミンピロリン酸酵素の分子生物学とその病態" ビタミン. 66. 635-641 (1992)
• [Publications] Kichiko Koike: "Pyruvate dehydrogenase deficiency due to two single base-pair substitutions in exon 5 and 6 of the α subunit gene of the pyruvate dehydrogenase" Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition. 13. 211-221 (1992)