真核細胞染色体複製開始の細胞周期による制御機構の研究

1993 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 04044114
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 杉野 明雄 大阪大学, 微生物病研究所, 教授 (90231737)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): MORRISON Ala National Institutes of Health, National I, 室長 ; JOHNSTON Lel National Institute for Medical Research, 部長
• Keywords: 真核細胞染色体複製 / 出芽酵母 / 細胞周期 / CDC / 蛋白リン酸化酵素 / DNAポリメラーゼ / DNAヘリカーゼ / 一本鎖DNA結合蛋白

Research Abstract

出芽酵母染色体DNA複製開始を細胞周期に依存し調節しているCDC7遺伝子産物であるCdc7蛋白リン酸化酵素は、同様に複製開始を調節しているDBF4遺伝子産物と複合体を作った時だけ活性化される。この活性化されたCdc7複合体を精製することに成功し、実際、Dbf4蛋白が複合体の1つに含まれていることを明らかにした。この複合体は、精製したDNAポリメラーゼI(α)-primase複合体のp180蛋白(ポリメラーゼ触媒蛋白)をin vitroで特異的にリン酸化し(他のDNAポリメラーゼII(ε)やIII(δ)の複合体はリン酸化されない)、その部位はin vivoでリン酸化された部位とほぼ同一であることが明らかになった。また、染色体DNA複製開始反応や伸長反応に関与していると考えられる一本鎖DNA特異的結合蛋白(yRFA)のp70とp34蛋白もCdc7複合体でリン酸化されることが明らかになった。これらの結果はCdc7蛋白リン酸化酵素活性が染色体DNA複製開始を制御していることを強く示唆する。一方DNAポリメラーゼδ及びεの補助因子と考えられるRF-C複合体の1つのサブユニットであるp40蛋白遺伝子をクローニングし、その塩基配列を決定した。単離した遺伝子を使用した遺伝子破壊実験より、p40蛋白は細胞増殖に必須であることが明らかになった。塩基配列より予想されるアミノ酸配列は既に決定されているヒト細胞のRF-C複合体の1つのサブユニットである37-KDa蛋白と非常に似ていることから、p40はヒトRF-C37-KDa蛋白のhomologであると結論した。また、このp40を大腸菌で多量発現させ、精製し、その蛋白が持っている生化学的活性を詳細に調べた。その結果、p40蛋白はRF-C複合体の中心的活性であるプライマー部位を認識し結合してDNAポリメラーゼδやεを呼び込む活性を持つことが明らかになり、このp40がRF-C複合体の主要な働きをしていることが明らかになった。

Research Products

• [Publications] Kunio Kitada,Anthony L.Johnson,Leland H.Johnston,and Akio Sugino: "A multicopy suppressor gene of the Saccharomyces cerevisiae Gl cell cycle mutant gene dbf4 encodes a protein kinase and is identified as CDC5" Molecular and Cellular Biology. 13. 4445-4457 (1993)
• [Publications] Alan Morrison,Anthony L.Johnson,Leland H.Johnston,and Akio Sugino: "Pathway correcting DNA replication errors in Saccharomyces cerevisiae" The EMBO Journal. 12. 1467-1473 (1993)
• [Publications] Kikuo Shimizu and Akio Sugino: "Purification and characterization of DNA helicase III from the yeast Saccharomyces cerevisiae" The Journal of Biological Chemistry. 268. 9578-9584 (1993)
• [Publications] Kikuo Shimizu,Carrado Santocanale,Philip A.Ropp,Maria P.Longhese,Paolo Plevani,Giovanna Lucchini,and Akio Sugino: "Purification and characterization of a new DNA polymerase from budding yeast Saccharomyces cerevisiae:a probable homolog of mammalian DNA polymerase β" The Journal of Biological Chemistry. 268. 27148-27153 (1993)
• [Publications] Alan Morrison and Akio Sugino: "Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology" Academic Press,Inc., 30 (1993)