リグノセルロース系資源の生物燃料への変換を律速する微生物グリカナーゼの特異性改変

1992 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 04203219
• Research Institution: Mie University
• Principal Investigator: 嶋田 協 三重大学, 生物資源学部, 教授 (20024549)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 粟冠 和郎 三重大学, 生物資源学部, 助教授 (20154031) ; 大宮 邦雄 三重大学, 生物資源学部, 教授 (60023488)
• Keywords: リグノセルロース / キシラナーゼ / キチナーゼ / キチナーゼ遺伝子 / セルロース吸着ドメイン / 改変酵素

Research Abstract

リグノセルロース系物質を生物燃料へ変換するための最大の難点は、それらの水溶化が容易でないことにある。この水溶化効率を高めるために、セルロース、キシランあるいはキチンを構成するβ-1,4-エーテル結合を分解できる微生物酵素群の機能の解明と改良に関する基礎的データーの集積を目的として本研究を行った。
1)C.stercorarium F-9株のキシラナーゼXynAの修飾と特性解析 C.stercorarium F-9株のキシラナーゼXynAをコードするDNA断片は2361個の塩基配列(551アミノ酸)を含んでいた。開始コドンより30アミノ酸下流に翻訳産物のN-末端アミノ酸配列が見いだされた。構造遺伝子のほぼ中央にフレキシブル構造領域が存在していた。その下流のNsiIサイトにストップコドンリンカーを挿入しXyn分子のC-末端側約半分を欠損させることにより、分子量が54,000から28,000に減少した改変酵素を調製できた。この改変酵素は至適のpHやpH安定領域、基質に対する酵素の親和性などに化がなかったが、温度安定性が70℃から75℃に、また比活性が2倍になった。結局、XynA分子のN-末端側約半分にファミリーGに属する活性ドメインの局在が判明した。その活性サイト付近にはファミリーGのキシラナーゼに共通するアミノ酸配列が保存され、124Gluが活性中心であると推定できた。一方、XynA分子のC-末端側約半分は、セルロースへの吸着ドメインと断定した。
2)キチン分解菌の同定と培養 土壌より分離したキチン分解嫌気性菌M-21株は、グラム陽性で運動性のあるかん菌で極胞子を形成する中温中性菌で、カタラーゼ活性を持たない。本菌はキチンを資化し、約60%の水素を含む可燃性のガスを生成する偏性嫌気性菌Clostridium paraputrificumと同定された。本菌の染色体より、3種類のキチナーゼ遺伝子のクローニングに成功している。

Research Products

• [Publications] Kazuo Sakka: "Nucleotide sequence of the Clostriolium stercorarium XYEA gene encoding xylanaee A;Identification of catalytic and cellulose binding domains." Biosci.Biotech.Biochem.57(2). 273-277 (1993)
• [Publications] Kazuo Sakka: "Nucleotide sequence of the slostridium stercorarium XYEA gene enconding a bifunctional proteins with B-O-XYE osidase and α-L-arabinofuranse activities,and properties of the translated product" Biosci.Biotech.Biochem.57(2). 268-272 (1993)
• [Publications] 大宮 邦雄: "植物繊維分解ルーメン細菌における遺伝子工学" 日本畜産学会報. 63(5). 64-80 (1992)
• [Publications] Tsuchiyoshi Fujino: "Nucleotide sequence of an endo-1,4-β-glucanase gene(cel A) from clostridiumjosui" J.Ferment.Bioeng.73(4). 308-313 (1992)
• [Publications] Masayuki Takano: "Structure of a β-glucosidase gene from Ruminococcus albus and properties of the translated product" J.Ferrment.Bioeng.73(2). 79-88 (1992)
• [Publications] Yuichi Watanabe: "Punfication and properties of the endo-1,4-glucamase III from Ruminoccoccus albus" F.Ferment.Bioeng.73(1). 54-57 (1992)
• [Publications] Kyo Shimada ed by Y.Murooka & T.Imanaka: "Recombinant Microbes for Industrial and Agrieultural Arplications" Marcel Dekker Inc, 500 (1993)
• [Publications] Kazuo Sakka ed by M.Kuwahara and M.Shimada: "Biotechnology in pulp and paper industry" Uni Publishers, 545 (1992)