1992 Fiscal Year Annual Research Report
家族性アミロイドーシスの発症機構と血清アミロイドP成分の関与-ジーンターゲティングによる解析
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04260220
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
前田 秀一郎 熊本大学, 医学部, 助教授 (10117244)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
瀬戸山 千秋 熊本大学, 医学部, 講師 (60040250)
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| Keywords | アミロイドーシス / 血清アミロイドP成分 / ジーンターゲティング / 相同DNA間組換え / 胚性幹細胞 / 遺伝性疾患 / トランスサイレチン(プレアルブミン) / トランスジェニックマウス |
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| Research Abstract |
1.C3H/Heマウスの血清アミロイドP成分(sap)遺伝子領域で、次のようなジーンターゲティングベクターを構築した。[5′flankingregion(約2kb)及び3′-flanking region(約2.5kb)を含む全sap遺伝子の第2エクソンに、マウスの胚性幹(ES)細胞で発現するMC1プロモーターに接続したG418耐性遺伝子を挿入し、さらにMC1プロモーターに接続したヘルペスtk遺伝子を両端に接続したもの。]
2.上記1.のベクターをマウスES細胞に導入して得たG418及びgancyclovirに耐性の約240個の細胞の各々からDNAを抽出した。
3.上記2.のDNAの各々をEcoR1制限酵素で切断し、sap遺伝子の5′端をプローブとして、サザーンブロット法で遺伝子標的組み込みES細胞株を検索した。この方法では、内在性の正常sap遺伝子は、5.8kbのバンドとして、また、第2エクソンに挿入変異をもつsap遺伝子は、2.6kbのバンドとして検出される。約2.6kbのバンドを認めた6個のクローンについて、PCR法で、ジーンターゲティングの有無を調べた。しかし、変異遺伝子に特異的なフラグメントの増幅が無く、調べた約240個中には遺伝子標的組み込み細胞株は存在しないと結論した。
我々は、先に同様の手法を用いてマウスES細胞のトランスサイレチン(ttr)遺伝子に挿入変異を導入した。この場合にはG418及びgancyclovirに耐性となった約130個の細胞のうち、6個が遺伝子標的組み込み株であった。今回の研究結果は、ttr遺伝子領域よりsap遺伝子領域の方がジーンターゲティングの効率が極めて低いことを示している。この点に関して、最近、宿主ES細胞の遺伝子で作製したベクターを用いると、ジーンターゲティングの効率が著しく高まることが報告された。そこで、ES細胞の由来した129/Sv//Evマウスのsap遺伝子で作製したベクターを用いることを計画し、準備を進めている。
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[Publications] Murakami,T.er al.: "A Novel Transthyretin Mutation Assoceated with Familial Amyloidotic Polyneuropathy" Biochem.Biopys.Res.Commun.182. 520-526 (1992)
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[Publications] Murakami,T.et al.: "Effect of Serum Amyloid P Component Level on Transthyretin-derived Amyloid Deposition in a Transgenic Mouse Model of Familial Amyloidotic Polyneuropathy" Am.J.Pathol.141. 451-456 (1992)
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[Publications] Murakami,T.et al.: "A Novel Transthyretin Mutation at Potition 30 (Leu for Val)Associated with Familial Amyloidotic Polyneuropathy" Biochem.Biophys.Res.Commun.187. 397-403 (1992)
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[Publications] Episkopou,V.et al.: "Disruption of the Transthyretin Gene Results in Mice weth Depressed Levels of Plasma Retinol and Thyroid Hormone" Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.
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[Publications] yamamura,K.et al.: "in Molecular Approaches to the Study and Treatmen of Human Diseases,Analysis of the Pathological Process of DominantDisease:Familial Amyloidotic Polyneuropathy" (Yoshida,T.O.& Wilson,J.M.,eds.)Elsevier Science Publishers,B.V.,Amsterdam, 8 (1992)
