リペ多糖刺激を介して血管内皮細胞で発現する組織因子の分子機能解析

1992 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 04263231
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 岩永 貞昭 九州大学, 理学部, 教授 (90029942)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 川畑 俊一郎 九州大学, 理学部, 助手 (90183037)
• Keywords: 血管内皮細胞 / 組織因子 / VIIa / VII因子 / cDNAクローニング / リコンビナント / 糖タンパク質 / 酵母 / 血液凝固因子

Research Abstract

先ず従来から知られているヒト、マウスのTFの塩基配列をもとに、17mer、20merのオリゴヌクレオチドプライマー2種を作製し、ウシ副腎皮質cDNAライブラリーを鋳型にPCR反応を行ない、491bpよりなるDNA断片を得た。この断片の塩基配列より、TFのcDNAの一部であることを確認後、プローブに用い100万個のクローンをスクリーニングし、約1.6kbよりなるポジティブクローンを一個得た。このクローンの末端塩基配列を決定したところ、開始Metコドンを含み、35残基のシグナル配列に続いて、ウシTFのアミノ末端配列がコードされていた。また、これまで報告されている3種のTFは全て260残基前後よりなることから、このクローンはウシ組織因子の全領域を含むと考え、全塩基配列を決定した。その結果、ウシTFは35残基のプレ配列を含む257残基から成る糖タンパン質であり、C末端領域に23残基の膜貫通ドメイン、さらに21残基の細胞質ドメインを含むことが明らかとなった。Asn型糖鎖は残基番号8と118、146の3ケ所に存在する可能性が強く、推定分子量は32,000と算出される。
さらにこのcDNAを用い、酵母での可溶性TF(rsTF)を発現を試みた。重松が可溶性ヒトTFの発現に用いた方法に従い、pAM82にウシTFの細胞外ドメイン(1-213)を挿入した発現ベクターを構築した。このベクターを用いrsTFを発現させた結果、CM-Sepharoseカラムの1ステップだけで培地1リットルあたり約2mgのrsTFを得る事ができた。このrsTFはSDS-PAGE上、38kDaの単一バンドを示し、糖鎖の付加が予想された。また、アミノ酸分析、配列分析を行ったところ、cDNAの塩基配列より予想される結果と一致した。さらに、合成基質を用いたVII因子の測定系において、rsTFは天然ウシTFとほぼ同程度の増強効果を示し、VII因子-TFの分子間相互作用の研究に活用できることがわかった。

Research Products

• [Publications] Yoshike Miura: "Preparation and Properties of Monoclonal Antibodies against Lipopolysaccharide-Sensitive Serine Protease Zymogen,Factor C,from Horseshoe Crad (Tachypleus tridentatus)Hemocytes." J.Biochem.112. 476-481 (1992)
• [Publications] shouichi Higashi: "Tissue Factor Potentiates the Factor VIIa-catalyzed Hydrolysis of an Ester Substrate." J.Biol.Chem.267. 17990-17996 (1992)
• [Publications] Hitoshi Nishimura: "Human Factor X Has a Tetrasaccharide O-Glycosidically Linked to Serine-61 through the Fucose Residue." J.Biol.Chem.267. 17520-17525 (1992)
• [Publications] Yoshikatsu Shigematsu: "Expression of Human Soluble Tissue Factor in Yeast and Enzymatic Properties of Its Complex with Factor VIIa." J.Biol.Chem.267. 21329-21337 (1992)
• [Publications] Hiroyuki Takeya: "Coagulation Factor X Activating Enzyme from Russell's Viper Venom(RVV-X):A Novel Metalloproteinase with Disintegrin (platelet aggregation inhibitor)-like and C-type Lectin-like Domains." J.Biol.Chem.267. 14109-14117 (1992)
• [Publications] Toshiyuki Miyata: "Prothrombin Salakta:Substitution of Glutamic Acid-466 by Alanine-Reduces the Fibrinogen Clotting Activity and the Estarase Activity." Biochemistry. 31. 7457-7462 (1992)
• [Publications] 東 昌市: "Annual Review血液1992" 中外医学社, 12 (1992)
• [Publications] 宮田 敏行: "血管と内皮2巻.2号" メディカルレビュー社, 7 (1992)