ソルビトール合成律速酵素のcDNAクローンの調製とそれによる糖集積機能の解析

1993 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 04454052
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 山木 昭平 名古屋大学, 農学部, 教授 (70210341)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 金山 喜則 名古屋大学, 農学部, 助手 (10233868) ; 今関 英雅 名古屋大学, 農学部, 教授 (90023431)
• Keywords: ソルビトール-6-リン酸脱水素酵素 / S6PDH / S6PDHのcDNAクローン / ソルビトール脱水素酵素 / SDH

Research Abstract

リンゴ実生より精製したソルビトール-6-リン酸脱水素酵素(S6PDH)のcDNAのクローニングに成功した。このcDNA及びS6PDHの抗体を用いてリンゴ実生におけるS6PDHの発現を検討した。イムノブロッティングによりS6PDH活性の上昇と翻訳活性の上昇が一致し、発芽に伴うS6PDH活性の誘導がde novoの合成であることが分かった。しかしながらこのcDNAをプローブにしたノーザンブロッティングによるS6PDH特異的なmRNAの発現は、S6PDHタンパク質合成よりも2日も早く誘導された。S6PDHの器官特異性をS6PDH抗体を用いて検討したところ、発現部位はソースである子葉及び本葉で強く、根、茎及び果実においては活性、タンパク質とも殆ど検出出来なかった。S6PDHの種間差を成葉から抽出したタンパク質のイムノブロッティングで検討したところ、モモ、ニホンナシ、セイヨウナシにおいてもリンゴS6PDHとほぼ同じ分子量のS6PDHを検出することが出来た。またリンゴ子葉及び発育枝葉においてソルビトール合成と関連すると考えられるS6PDH活性の変動が見られ、イムノブロッティッグによる分析から、いずれも酵素の活性化および不活性化ではなくタンパク質量の増減を伴うものであった。
一方、ソルビトール代謝の律速酵素の一つであるソルビトール脱水素酵素(SDH)をリンゴ果実より精製することに成功した。本酵素の植物からの精製は初めてである。リンゴ果実からの粗酵素液をブチルトヨパール、DEAE-セルロース、ブルーセファロース、Superose6ゲルクロマトにより、SDS-PAGEゲルにより一本のバンドになるまで精製した。本酵素は62kDaサブユニットの2量体からなる分子量12万のタンパク質である。キネティックスより本酵素はソルビトールをフルクトースに変換する方向に働くことが明かとなった。今後、SDHのcDNAのクローニングを行う予定である。

Research Products

• [Publications] Y.Kanayama: "Purification and properties of NADP-dependent sorbitol-6-phosphate dehydrogenase from apple seedlings" Plant Cell Physiol.34. 819-823 (1993)
• [Publications] 金山喜則: "果実が甘くなるしくみ" 化学と生物. 31. 578-587 (1993)