遺伝子操作によるリグニン・β-エーテル型結合の選択的開裂反応システムの開発

1993 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 04454088
• Research Institution: Tokyo University of Agriculture & Technology
• Principal Investigator: 片山 義博 東京農工大学, 共同研究開発センター, 助教授 (10214339)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 川合 伸也 東京農工大学, 農学部, 助手 (90202027)
• Keywords: リグニン分解 / β-アリールエーテル結合 / β-エーテラーゼ / Cα-デヒドロゲナーゼ / DNA塩基配列 / 遺伝子機能 / グルタチオン-S-トランスフェラーゼ / グルタチオン

Research Abstract

本研究は、リグニンが植物特に樹木成分として多量に生産され自然界の芳香族化合物の主要成分を構成し、しかもその分子結合の50%以上がβ-エーテル型結合から構成されている事に着目し、微生物の保持する環元的β-エーテル開裂酵素機能を用いて、このβ-エーテル結合を切断することによりリグニンの断片化・低分子化を計り、特異性の高い而も温和な脱リグニン法或いは特異性の高い物質変換プロセスを開発することを目指した。
平成5年度は既に単離解析に成功したβ-エーテル結合開裂酵素遺伝子およびCα-脱水素酵素遺伝子、またβ-エーテル結合開裂酵素の安定化に関与すると思われた遺伝子領域の機能解析を行う。そしてβ-エーテル結合の選択的完全開裂を行なうに必要な一連の酵素遺伝子の、共役的発現を可能とする遺伝子構造を設計構築するとともに、大腸菌での酵素系生産システムを用いて大量生産された一連の酵素系の保持する高分子リグニン中のβ-エーテル結合の選択的開裂機能を詳細に評価する事を目指した
まず本年度は、β-エーテラーゼ遺伝子を大腸菌において大量発現させその酵素活性レベルについて調査した。そのため大腸菌における強力なプロモーターとして代表的なlacプロモーターの下流に連結してその制御下で生産されるβ-エーテラーゼ活性を調べた。さらにCα-デヒドロゲナーゼ遺伝子についても同様lacプロモーターの下流に連結して生産される酵素活性を評価した。さらに両酵素遺伝子を共役的に発現させて効率的な酵素生産を行なうために、両遺伝子を含む遺伝子断片を同様にlacプロモーター制御下で発現させた所、単独のβ-エーテラーゼ遺伝子の発現に比べ約100の酵素活性を検出した。この酵素活性の著しい上昇の原因が、β-エーテラーゼ酵素の安定化或いは活性化に関与する蛋白質因子の可能性が考えられる事から、先ず高活性をもたらす遺伝子領域の解析を進めた。その結果、Cα-デヒドロゲナーゼ遺伝子と、昨年度明らかにされたβ-エーテラーゼ遺伝子領域の間に、新たなしかも強力な活性を有するβ-エーテラーゼ遺伝子が直列に並んでいる事が明らかとなった。その遺伝子解析の結果、β-エーテラーゼがグルタチオン-S-トタンスフェラーゼというグルタチオンを補酵素とする酵素の一群に属する事を突き止めた。その結果、大腸菌で生産されるβ-エーテラーゼ活性は、元株である土壌細菌の酵素活性の800倍以上の酵素活性の上昇を達成した。
本年度は、グルタチオンを補酵素とすることによって飛躍的に上昇した活性を示す大腸菌の粗酵素液を用いて、合成高分子リグニン上に分布するβ-エーテル結合への分解機能を調査した。高分子上のβ-エーテル結合は、大腸菌粗酵素によって速やかに解離される事が明らかにされた。

Research Products

• [Publications] E.Masai,Y.Katayama,他4名: "A bacterial enzyme degrading the model lignin compound β-etherase is a member of the glutathione-S-transferase superfamily" FEBS LETTERS. 323. 135-140 (1993)
• [Publications] E.Masai,S.Kubota,Y.Katayama他3名: "Characterization of the Cα-Dehydrogenase Gene Involved in the Cleavage of β-Aryl Ether by Pseudomonas paucimobilis." Bioscience Biotechnology Biochemistry. 57. 1655-1659 (1993)