16SrRNAの種および属に特異的な配列を利用する海洋細菌の現場での検出と計数

1993 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 04454097
• Research Institution: HIROSHIMA UNIVERSITY
• Principal Investigator: 清水 潮 広島大学, 生物生産学部, 教授 (30101083)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山本 民次 広島大学, 生物生産学部, 講師 (40240105) ; 松田 治 広島大学, 生物生産学部, 教授 (60034469)
• Keywords: リボソームRNA / 海洋細菌 / ビブリオ・ハーベイ / DNAプローブ

Research Abstract

非放射性標識物質であるビオチンを結合した16SrRNA-標的プローブを使用し,メンブレン上の海洋細菌の16SrRNAとのハイブリダイゼーションの後、発光法、発色法による検出を目的として、方法の検討を行った。
主に使用した菌はVibrio harveyiであったが,対照としてEscherichia coliおよびAlteromonas haloplanktisなど8種の菌を用いた。使用したプローブは,全部の菌に相補性を持つユニバーサルプローブとV.harveyiだけに特異的に相補性を持つHarveyi-1プローブおよびHarveyi-2プローブであった。実験では、ハイブリダイゼーション法についての様々な条件、すなわち適切なメンブレンの選択、使用するバファーの組成についての検討,ハイブリダイゼーションと洗浄時の温度、時間、プローブの量などの条件の検討,また、検出時条件の検討などを行った。
実験の結果、検出を発光法で行なった場合、10^4程度の数の細菌が存在すれば検出が可能になった.しかし,V.harveyiだけに完全な相補性をもつプローブを使用したとき、V.harveyiとそれ以外の9種類の菌に発光シグナルが現れ,菌の固定・溶菌、ハイブリダイゼーション、検出の条件を様々に変えても、特異性を高めることは出来なかった。検討の結果,使用した海洋細菌、とくにA.haloplanktisの菌体には発光試薬に反応して発光を起こさせる物質のあることが分かった。検出法をBCIP/NBT試薬を用いて、発色法によって行った。この場合V.harveyiとE.coliとの区別はできたが,V.harveyiと他の海洋細菌とくにA.haloplanktisとの十分な種特異性をもつような方法の確立には至らなかった。