スクアレン・エポキシターゼの発現調節機構と酸素添加酵素の分子進化

1992 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 04454155
• Research Institution: Niigata University
• Principal Investigator: 小野 輝夫 新潟大学, 医学部, 教授 (00000927)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 榊原 順 新潟大学, 医学部, 助手 (90242403) ; 人見 雅浩 新潟大学, 医学部, 助手 (40218730) ; 藤井 博 新潟大学, 医学部, 講師 (90165340)
• Keywords: スクアレン・エポキシダーゼ / 酵母 / ラット

Research Abstract

1.スクアレン・エポキシダーゼ(SE)遣伝子(wild type yeast)の単離と性状:SE(mutant yeast)の塩基配列を参考にSaccharomyces cerevisiae genomic libraryよりSE遣伝子(wild type yeast)を単離した。塩基配列を決定した結果、FAD結合部位と推定される配列を見出した。また、蛋白をコードする497個の推定アミノ酸配列のうち249番目のLがmutantではFに置換し、SE阻害剤であるterbinafineに耐性を示すことを明らかに出来た。
2.スクアレン・エポキシダーゼ(SE)rat cDNAの単離と性状:rat肝臓cDNA libraryをSchizosaccharomyces Pombeに導入し、酵母SEを阻害し哺乳類SEを阻害しない薬剤であるterbinafineを用いてselectionし、相補するcDNAのスクリーニングを行なった。その結果、70万クローンのうち1個のterbinafine耐性クローンを見出した。このクローンが酵母染色体の変異によるものでないことは、クローンからプラスミドを抽出し、改めて酵母に導入してもterbinafine耐性であることから確かめられた。また、プラスミドを導入した酵母は、哺乳類SEのみに有効な阻害剤(NB598)の存在下でも生育可能であったがNB598とterbinafineを共に添加した培地では生育出来ず、この酵母には酵母、ラット双方のSEが発現されていると推定された。このプラスミドにはラットSEがコードされていると考えられ、塩基配列を決定した結果、全長2230ntより成り、573個のアミノ酸より成るDRFを有していた。N-端近傍には膜結合ドメインに与かると推定される疎水性アミノ酸領域、FAD結合部位と推定されるβ_1-αA-β_2motifの存在を確認した。酵母とラットのSEはアミノ酸で35.6%のホモロジーを示した。また、ラットSEの大腸菌による発現系を構築した結果、組み換えラットSEがSE酵素活性を持っていることも明らかとなった。

Research Products

• [Publications] 榊原 順: "ラットスクアレン・エポキシダーゼの構造と機能" 第15回日本分子生物学会年会報. 15. 200- (1992)
• [Publications] Hiroshi Fujii: "Cloning of a cDNA encoding rat intestinal 15 kDa protein and its tissue distribution" Biochem.Biophys.Res.Commun.190. 175-180 (1993)