スクアレン・エポキシダーゼの発現調節機構と酸素添加酵素の分子進化

1993 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 04454155
• Research Institution: Niigata University
• Principal Investigator: 小野 輝夫 新潟大学, 医学部, 教授 (00000927)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 人見 雅浩 新潟大学, 医学部, 助手 (40218730) ; 藤井 博 新潟大学, 医学部, 助教授 (90165340) ; 榊原 順 新潟大学, 医学部, 助手 (90242403)
• Keywords: スクアレン・エポキシダーゼ / sterol regulatory element (SRE) / コレステロール / フラビン酵素 / モノオキシゲナーゼ / ラット

Research Abstract

1.ラットスクアレン・エポキシダーゼ(RSE)cDNAの発現系とリコンビナント酵素の性状:T7プロモーターを用いた発現ベクターであるpET3のNdeI-BamHI断片にRSEのコーディング領野を挿入したRSE発現ベクターを作成し、ステロール合成能を欠く原核細胞E.coliにトランスフェクションベクターとして構築したcDNA全長(pET△^0RSE)、膜結合部位を削ったpET△^<49>RSE及びpET△^<99>RSEを発現させ酵素活性を確認した。更にpET△^<99>RSEのC単に5つのHisタグを付けたリコンビナント酵素を発現させニッケルカラムで精製、抗体作成及び酵素活性の再構成を行った。
2.RSEの代謝調節機構:各種培養細胞を用いリポタンパク質を超遠心機で除いた血清で培養した時、対照の血清に比べ明らかにSEが誘導されていることが、酵素活性、酵素タンパク質量、mRNAレベルで確かめられ、SEがコレステロール含有リポタンパク質により転写レベルで調節を受けていることを明らかにした。これと一致して、既知のコレステロール生合成の律速酵素であるHMG-CoA還元酵素並びに細胞へのコレステロール搬入の律速となるLDL-レセプターの遺伝子に共通して存在するシスエレメントとして知られるSRE(sterol regulatory element)と相同性を持つ塩基配列をRSEの遺伝子プロモーター領野に見出した。SEの持つRSE相同配列がステロール感受性を示すかどうか目下検討中である。
3.SEの分子進化:RSEの一次構造決定を基にホモロジーを示すタンパク質の検索では、酵母のアリルアミン耐性SE遺伝子以外見出せず、またペルオキシダーゼなどとも明らかに異なっていた。更に電子伝達系と共役するチトクロムP-450アイソザイムとの相同性も見出せず、これらとは異なった特異な進化をしたと推定される。

Research Products

• [Publications] 榊原 順: "ラットスクアレン・エポキシダーゼcDNAの単離とその性状" 脂質生化学研究. 35. 131-134 (1993)
• [Publications] Sakakibara,J.: "Molecular cloning and characterization of rat squalene epoxidase" Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91(in press). (1994)
• [Publications] 榊原 順: "スクアレン・エポキシダーゼ-もう1つのコレステロール合成律速酵素" 蛋白質核酸酵素. 39(印刷中). (1994)
• [Publications] 中村 裕一: "ラットスクアレン・エポキシダーゼ遺伝子の発現調節" 第16回日本分子生物学会年会報. 16. 194 (1993)
• [Publications] 榊原 順: "スクアレン・エポキシダーゼの構造と機能" 第16回日本分子生物学会年会報. 16. 385 (1993)
• [Publications] Fujii,H.: "Cloning of a cDNA encoding rat intestinal 15 kDa protein and its tissue distribution" Biochem.Biophys.Res.Commun.190. 175-180 (1993)