PCR産物直接塩基配列決定による結核の疫学的研究

1992 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 04454228
• Research Institution: Osaka Prefectural Institute of Public Health
• Principal Investigator: 牧野 正直 大阪府立公衆衛生研究所, 微生物課, 微生物課長 (00116097)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 鈴木 定彦 大阪府立公衆衛生研究所, 病理課, 研究員 (90206540) ; 勝川 千尋 大阪府立公衆衛生研究所, 微生物課, 主任研究員 (20183725) ; 東 逸男 大阪府立公衆衛生研究所, 微生物課, 主任研究員 (00250275)
• Keywords: リボゾームRNA遺伝子 / 16S・23S非コード領域 / PCR / 結核の疫学的研究 / PCR産物直接塩基配列決定 / 抗酸菌

Research Abstract

学校や塾における集団発生や海外からの移入等は、今日結核感染において注目されている問題の一つである。しかし、原因菌に対する疫学的調査の方法はこれまでに確たるものは存在していない。そこで我々は結核菌の疫学的同定法の確立を目指して研究を進めている。今年度は、16SリボゾームRNA(rRNA)遺伝子と23SrRNA遺伝子の間の非コード領域の構造の多様性に着目し、この部分の塩基配列を決定、比較することにより結核菌の疫学的同定が可能かどうかについて検討を行なった。
1)プライマーの合成および選択
プライマーは16SrRNA遺伝子の3'末端付近と23SrRNA遺伝子の5'末端付近で、様々な菌種の間で保存性に基づいて選択し、ABI社製DNAシンセサイザーにて合成した。つづいて、結核菌H37Rv株より抽出したDNAを鋳型としてプライマーのペアおよび反応条件の検討を行なった。その結果、用いた全ての抗酸菌株の16S-23S非コード領域を増幅させることのできるPCRの条件が確立できた。
2)塩基配列の決定および比較
結核菌3株及び他の抗酸菌17株よりPCRにより16S-23S非コード領域を増幅し、大腸菌ベクターpUC18にサブクローニングした。得られたプラスミドDNAを鋳型としてA.L.F.DNAシーケンサにより塩基配列を決定後、それぞれの比較を行なった。その結果、類縁性の低いとされている抗酸菌同志で多数の塩基置換が見られたのみならず、結核菌どうしにも小数ではあるが塩基置換が見られた。これは、16S-23S非コード領域がPCR産物直接塩基配列決定による結核の疫学的研究に利用できる領域である可能性を示すものである。今後PCR産物直接塩基配列決定の方法を確立し、更に数多くの抗酸菌についてこの領域の増幅と塩基配列を決定・比較を行ない、この方法の結核菌の疫学的同定に対する有効性について検討してゆきたい。