ジストロフィン関連遺伝子のクローニング

1992 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 04454258
• Research Institution: National Center of Neurology and Psychiatry
• Principal Investigator: 荒畑 喜一 国立精神・神経センター, 神経研究所, 部長 (30053325)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 平澤 恵理 国立精神, 神経センター・神経研究所, 研究生 ; 織茂 智之 国立精神, 神経センター・神経研究所, 研究生 ; 林 由起子 国立精神, 神経センター・神経研究所, 流動研究員 ; 塚原 俊文 国立精神, 神経センター・神経研究所, 研究員 ; 石浦 章一 東京大学, 応用微生物研究所, 助教授
• Keywords: ジストロフィン / ジストロフィン関連遺伝子 / 筋ジストロフィー / 遺伝子解析

Research Abstract

本研究は、ヒト大脳および骨格筋のcDNAライブラリーからジストロフィン関連遺伝子を単離し(クローニング)、神経・筋疾患の病因関連遺伝子の同定を目指すものであるが、今年度は(1)ジストロフィン関連遺伝子の単離を、ヒト胎児大脳と骨格筋のcDNAライブラリー(λgt10)から行った。そのためにファージのtiter測定、ファージDNAの調製等を実施した。(2)ジストロフィン関連遺伝子(スペクトリン・スーパーファミリー)の増幅は、まずdegenerate-PCRにより実施した。この目的に用いるdegenerateプライマーは、ジストロフィン、スペクトリン、d-アクチニンで共通に保存されている(conserved sequence)N末端側のアミノサン配列(KTFTK/AW)よりデザインした。もう一方のプライマーはファージアームを用いた。さらに(3)サブクローニングには、得られたDNAを各種の制限酵素(EcoRI、NotI、Sall等)で処理した後pBSIISK+プラスミドベクターにligationした後、これをTB-1にトランスフェクトし(形質転換)た。そして目的のプラスミドが入ったコロニーはX-Gal/IPTG selectionで選抜し、アガロース電気泳動でインサートを確認した。引き続き(4)プラスミドミニプレップの後、得られた全てのクローンについてそれらのシークエンスを行い、各々の塩基配列を検討した。さらに、コンピューター解析を実施している(GenBank、GenEmbl)。今後、ノーザンブロッティング解析により、細胞で発現しているmRNAの解析や、単離されたジストロフィン関連遺伝子のコードする遺伝子産物の情報を得る為に、融合タンパクに対する特異抗体を調製する予定である。

Research Products

• [Publications] Koga,R.,Ishiura,S.,Arahata,K. et al.: "Quantitative analysis of dystrophin in human and rodent muscles." Biomed.Res.13. 215-219 (1992)
• [Publications] Hoffman,E.P.,Arahata,K.,Minetti,C. et al.: "Dystrophinopathy in isolated cases of myopathy in females." Neurology. 42. 967-975 (1992)
• [Publications] 荒畑 喜一: "筋ジストロフィーの遺伝子診断" 医学のあゆみ. 162. 630-636 (1992)
• [Publications] Arahata,K.and Sugita,H.: "Cellular Membrane" Ohnishi,S.and Ohnishi,T.:CRC Press, 412 (1992)