強免疫原性ヒト悪性黒色腫抗原遺伝子の発現機構解析とその特異的能動免疫療法への応用

1994 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 04454287
• Research Institution: Kobo University
• Principal Investigator: 林部 一人 神戸大学, 医学部, 講師 (40198875)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 堀田 博 神戸大学, 医学部, 教授 (40116249) ; 市橋 正光 神戸大学, 医学部, 教授 (00030867)
• Keywords: 悪性黒色腫 / 抗腫瘍免疫療法 / ワクチン / 黒色腫関連抗原 / 遺伝子工学 / 組み換え蛋白質

Research Abstract

当研究計画の最終年度として、強免疫原性ヒト悪性黒色腫抗原および、そのコードする遺伝子の組織分布をまず確定した。方法はpMAL vectorにおいて発現させた当該遺伝子産物(D-1蛋白抗原)をBalb/cマウスに免疫して獲得した抗D-1多クローン性抗体による免疫組織化学染色と、D-1 cDNAを組み込んだp Bluescriptにより転写させて獲得したcRNAプローブを用いたIn-situ hybridization によった。結果、約40例の悪性黒色腫病巣にD-1 cRNA に対するmRNAの発現を確認した。黒色腫で陰性のものはなかったが、その発現k度合には強弱が認められた。In-situ hybridization に用いた標本の連続切片を用いて行った免疫染色では、mRNAの発現のある細胞に一致して、膜におけるD-1蛋白抗原の発現をみた。ただ、組織切片によっては膜よりも、むしろ細胞質に抗D-1抗体染色陽性所見を強く認めるものもあり、同抗原の膜表面への発現に特定のHLA分子の関与が示唆された。
組み換え蛋白D-1抗原により刺激されたT細胞の細胞障害活性については、Stage IV患者より得た末梢リンパ球および培養黒色腫細胞を用いてAutologousなsystemで行った。Co-cultute後、約14日間は対象コントロール細胞として用いたK562と同程度の殺傷効果しか示さなかったが、28日間培養するとK562に対してより、黒色腫細胞に対する殺傷効果が上まわって観察され、D-1抗原に特異的な細胞群のclonalなexpandionか推定される。また、もう一つの課題であったD-1クローン以外のクローンの核酸配列検索では、相同性検定によりE.coli由来のgeneに強い相同性を認めたため、そのクローンは当該研究に適さないものと判断した。現在、血清中に抗D-1抗体の高力価を示す群と低力価群間でのHLA class Iの比較を行っている。

Research Products

• [Publications] HAYASHIBE,K: "Tissue distnbution of an immunogenic melanoma-associated antigen D-1." Pigment Cell Research. (in press). (1995)
• [Publications] Tsukamoto,H.: "The altered expresston of α-smooth muscle actin in basal cell epithelioma and its surrounding stroma" 130. 1994. (189-194)
• [Publications] 林部 一人: "能動免疫療法による悪性黒色腫の転移制御" Oncolgia. 27. 24-27 (1994)
• [Publications] 林部 一人: "無機物と色素(小川和朗,中根一穂,三島豊,水平敏和,鈴木康之,編)" (株)朝倉書店,東京, 335 (1994)