骨芽細胞のチロシンキナーゼをコードする遺伝子の機能と制御に関する研究

1994 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 04454462
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 松本 彰 北海道大学, 歯学部, 教授 (40064365)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 吉村 善隆 北海道大学, 歯学部, 助手 (30230816) ; 鈴木 邦明 北海道大学, 歯学部, 助手 (40133748) ; 久田 洋 北海道大学, 歯学部, 助教授 (20001018)
• Keywords: 骨芽細胞様細胞株 / Total RNA / mRNA / ノーザンブロット分析 / チロシンキナーゼ / 遺伝子 / ゲニステイン

Research Abstract

平成6年度に行った研究によって得られた結果
1.ノーザンブロット分析
(1)MC3T3-E1細胞からのTotalRNAの抽出技術は完成し、必要に応じて供給可能となり、ノーザンブロット分析の試料供給に不安は無くなった。
(2)アガロース電気泳動、ナイロンメンブレンへのトランスファー、遺伝子標識、ハイブリダイゼーション、オートラジオグラフィーなど、一連のノーザンブロット分析のための技術が完成した。
(3)Poly(A)^+RNAの抽出はDynabead's oligo(dt)25を用いて順調に行くようになった。
(4)cDNAがアマシャムのcDNA合成キットを用いて行えるようになった。
(5)λgt10 c-fgr cDNAクローニンを現在行っているところである。
(6)転写因子AP-1(c-fos c-junのヘテロダイマー)のGel Shift Assayが可能となった。
新知見
(1)MC3T3-E1細胞を10日間培養したのち、24時間無血清培養液に置き、牛胎児血清あるいはEGFの処理時間を0,5,10,15,30,60分間と細分して調べてみると、メッセージの発現が認められ、その程度は30分で最も高いことが判明した。
(2)上記のことは低カルシウム環境で増強されていることが認められ、経時的には30分において最も増強する程度が高いことが示された。
(3)EGF処理で増強したc-fos mRNA発現(低カルシウム環境下)の程度はチロシンキナーゼ阻害化学物質のゲニステインの併用で抑制された。
(4)転写因子のAP-1(c-fos c-junのヘテロダイマー)がGel Shift AssayでMC3T3-E1細胞に見い出された。
今後の研究の展開に関する計画
1.直接的なチロシンキナーゼmRNAの発現について:市販のチロシンキナーゼDNAプローブを用いて調べる。
遺伝子バンク(JCRB)からc-fgr c-srcの供給を得、大腸菌を用いて、増殖させる技術を完成させることが必要である。
2.チロシンキナーゼ遺伝子の転写活性について:NFχB,AP-1,TBP,TFIID,TFIIFなどについてGel Shift Assayを行ない調べる。

Research Products

• [Publications] Akira Matsumoto: "Intracellular free calcium and phosphatidylinsitol-1,4,5-triphosphate in bone cells cultured in a low calcium environment." J.Bone and Miner.Metabol.10. 1-7 (1992)
• [Publications] Yoh Hisada: "Changes of protein kinase C activity in rat calvarial bone cells cultured in a low-calcium environment." Archs.Oral Biol.37. 695-698 (1992)
• [Publications] Akira Matsumoto: "c-fos mRNA expression after treatment with fetal bovine serum and epidermal growth factor for osteoblastic MC3T3-E1 cells cultured in a low calcium environment." Biochem.Biophys.Res.Commun.193. 77-87 (1993)
• [Publications] Akira Matsumoto: "The changes of c-fos mRNA expression in the protein kinase C activatedosteoblastic MC3T3-E1 cells cultured in a low-calcium environment." Nucleic Acids Symposium Series. 29. 155-156 (1993)
• [Publications] Akira Matsumoto: "The change of DNA synthesis activity in the first molar tooth germ of neo-natal rat cultured in a low-calcium environment." Oral Therap.Pharmacol.12. 135-139 (1993)
• [Publications] Akira Matsumoto: "Inhibitory effect 1-(5-isoquinolinesulfonyl)-2-methy-piperazine on c-fos mRNA overexpression in osteoblastic MC3T3-E1 cells with the treatment of 12-O-tetracanoyl-phorbor13-acetate under a low-calcium environment in culture." Nucleic Acids Symposium Series. 31. 243-244 (1994)
• [Publications] 石木 哲夫・小椋 秀亮・編集: "歯科医学・歯科医療総論・II歯科医学総論-2" 医歯薬出版, 348 (1993)
• [Publications] Ogura H. ed.: "Pharmacological approach to the study of the formation and the resortpion mechanism of hard tissue." Ishiyaku Printing Co.Ltd., 186 (1994)