酵母における複製フォーク阻止システムの解析とその生理機能の研究

1992 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 04454616
• Research Institution: Okazaki National Research Institutes
• Principal Investigator: 堀内 高 岡崎国立共同研究機構, 基礎生物学研究所, 教授 (60108644)
• Keywords: 酵母 / 複製フォーク / 2次元寒天ゲル電気泳動 / rRNA / 組換えホットスポット / 分子生物学

Research Abstract

一般には複製フォークの染色体上を進む早さは一定と考えられている。しかし染色体上には複製フォークの進行を特異的に阻止する部位の存在が、種々の生物で最近明かにされ始めてきている。本研究では、酵母の複製フォーク阻害部位を取り上げ、その機構を明かにすることで、真核生物でのフォーク阻止システムの機構解明を目指している。
本年度の研究計画に挙げた項目については、ほぼその初期の目的を達成できた。すなはち、ゲノム上のフォーク阻害点(sogと呼ぶ)をクローン化したプラスミドを細胞から抽出し、それを2次元の寒天ゲル電気泳動法を用いて解析したところ、ゲノム上と同じ極性を示す阻害活性を検出出来た。このアッセイ法(sogアッセイと名付ける)を確立できたことより、酵母のフォーク阻害点の同定とその塩基配列を決定することが出来た。その結果、興味深いことに、この約100塩基対からなる阻害部位は、rRNA転写部位のエンハンサーの極めて近傍にあり、しかも相同組換えのホットスポットの一要素である部位と重なることが判明した。このことは大腸菌において我々が見いだしている、複製フォーク阻害点が組換えのホットスポットであることと現象的に一致しており、今後興味深い研究テーマである。さらにこの同定したsog部位に特異的に結合するタンパク質を、ゲルシフト法を用いて検索し、現在候補のタンパク質を得ることが出来た。今後このタンパク質の遺伝子を分離同定し、それが真のフォーク阻止蛋白か否かを調べ、これらの研究を通して酵母のフォーク阻止システムを明かにすると共に、その生理機構にも迫りたい。また、この部位に見られる組換えのホットスポット活性をより簡便に感度よく検出できるアッセイ法を確立し、ホットスポット活性とフォーク阻害活性との関係を明かにしたい。

Research Products

• [Publications] 日高 真純: "Termination complex in Eschorichia coli inkibits SV40 replication in vitro by impeding the action of T antigen helicase." J.Biol.Chem. 267. 5361-5365 (1992)
• [Publications] 小林 武彦: "Identification of a site required for DNA replication fork blocking activity in the rRNA gene cluster in Saccharo myces cerevisiae." Mol.Gen.Genet.233. 355-362 (1992)
• [Publications] 西谷 秀男: "Specific chromosomal sites enhancing homologous recombination in Eschovichia coli mutant detective in RNase H" Mol.Gen.Genet.