異なった生理的条件下の筋小胞体カルシウムATPaseの三次元構造解析

1992 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 04454618
• Research Institution: Tokyo Institute of Technology
• Principal Investigator: 豊島 近 東京工業大学, 生命理工学部, 助教授 (70172210)
• Keywords: 筋小胞体 / カルシウムATPase / イオンポンプ / 三次元構造 / 低温電子顕微鏡法 / 構造変化 / 蛋白質結晶 / 画像解析

Research Abstract

本年度はまずバナジン酸存在下で作製したチューブ状結晶の氷包埋クライオ電子顕微鏡法による三次元構造解析を分解能14A^^°で完成した。この結果、脂質二重膜中の構造が明らかになり、一次構造との対応もある程度つけられるものであった。従って、イオンの膜内の通路の位置を予想することができ、また、ATPが結合する位置に関しても候補が得られた。以上の結果は、現在ネーチャー誌に印刷中である。
この結果を踏まえて、次の目標を、ATP結合部位の同定とATP、Caイオン結合時の構造変化に置き、そのためにATPのアナログである、クロミウムATPの合成を行った。このアナログはCaイオン存在下でCa-ATPaseに結合し、加水分解されない。バナジン酸存在下でチューブ状結晶をクロミウムATPが結合したまま作れるかどうかが鍵であった。その検定のためにいくつかの方法を試したが、ATP分解活性を測ることと、原子吸光を測定することによって、少なくとも80%のCa-ATPaseはクロミウムATPを結合したままでいることを確認できた。現在、氷包埋法を用いて、データ収集を開始した。
一方、高濃度のCaイオン存在下で形成される三次元結晶に関しては、うまく再現できない状態が続いた。これは、Ca-ATPaseを色素カラムを用いてアフィニティ精製するさいに酵素が失活してしまうことや、脂質の取扱いが問題であることが判明した。この結果、二重膜が多数積み重なったタイプの結晶に関しては、8A^^°分解能の像が得られたが、まだ数が足りない。他の像に関してはどの方向から結晶を見ているかが問題になり、ソフトウエアの開発を急いでいる。

Research Products

• [Publications] Chikashi TOYOSHIMA: "Contrast transfer for the frozen hydrated specimen.II:Amplitude contrast at very low frequencies" Ultramicroscopy. (1992)
• [Publications] Ayano SATO: "Two-dimensional crystallization of catalase on a monolayer film of poly(1-benzyl-L-histidine)spread at the air/water interface;" Biochim.Biophys.Acta. (1993)
• [Publications] Chikashi TOYOSHIMA: "Cryo-electron microscopy of the calcium ion pump in the sarcoplasmic retlculum membrane" Nature,. (1993)
• [Publications] 豊島 近: "膜蛋白質の電子線三次元構造解析" 蛋白質・核酸・酵素. (1993)