異った生理的条件下の筋小胞体カルシウムATPaseの三次元構造解析

1993 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 04454618
• Research Institution: Tokyo Institute of Technology
• Principal Investigator: 豊島 近 東京工業大学, 生命理工学部, 助教授 (70172210)
• Keywords: 筋小胞体 / カルシウム / ATPase / 三次元構造解析 / 膜蛋白質 / イオンポンプ / 低温電子顕微鏡法

Research Abstract

本研究では、カルシウムATPaseの異なった状態での三次元構造を、氷包埋低温電子顕微鏡法によって解析し、能動輸送の構造的実体を明らかにすることを目標としている。本年度は、昨年度に引き続き、クロミウムATPを結合させた状態での三次元構造を解析した。クロミウムATPを結合させるためには、カルシウムが必要であり、このカルシウムは、膜内に閉じ込められた状態になる。しかし、チューブ状結晶を作製するためには、EGTA、バナジン酸が必要であり、チューブ状結晶ができた時点で、クロミウム、ATP、カルシウムが結合したままでいるかが問題であった。ATPase活性、クロミウムの原子吸光、カルシウムのトレーサー実験を行い、クロミウムとATPは結合しているが、カルシウムは抜けてしまっていることがわかった。この状態のチューブ状結晶を、ATP非存在下と同じ14A分解能で解析し、三次元構造を得た。らせん対称性の同じものを選ぶことができたので、ATP非存在下のものと詳細な比較が可能であった。その結果、ATP結合部位と予想していた細胞質側のくぼみが埋り、そのすぐ上の領域が蓋をするように動いたことが認められた。また、膜内のA、Bフラグメント、内腔側にも明瞭な変化が認められ、ATPの結合による構造変化が内腔側にまで伝わることが確かめられた。
一方、チューブ状結晶の歪みを補正する一連のプログラムは、一応実用になる段階に達し、カルシウムATPaseのチューブ状結晶にも適応したところ、回折パターンの著しい改善が認められた。従って、個々のらせんを可視化できる可能性は非常に高くなった。

Research Products

• [Publications] C.Toyoshima: "Three-dimensional cryo-electron microscopy of the calcium ion pump in the sarcoplamisc reticulum membrane." Nature. 362. 469-471 (1993)
• [Publications] C.Toyoshima: "Contrast transfer for the frozen hydrated specimen.II:Amplitude contrast at very low frequencies." Ultramicroscopy. 48. 165-176 (1993)
• [Publications] A.Sato: "Two-dimensional crystallization of catalase on a monolayer film of poly(1-benzyl-L-histidine)spread at the air/water interface." Biochim.Biophys.Acta. 1162. 54-60 (1993)
• [Publications] 豊島 近: "膜蛋白質の電子線三次元構造解析" 蛋白質・核酸・酵素. 38. 1276-1286 (1993)