キシログルカナーゼ遺伝子のクローニングと木質形質転換体ポプラの作出

1992 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 04455016
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 林 隆久 京都大学, 木質科学研究所, 助教授 (70231529)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 馬場 啓一 京都大学, 木質科学研究所, 助手 (20238223)
• Keywords: キシログルカナーゼ / オーキシン / ポプラ細胞

Research Abstract

ポプラ培養細胞由来のキシログルカナーゼ活性は、Buffer-soluble、Buffer-insolubleおよび Extracellularの3つに分画された。各々の画分に由来する活性は、それぞれ最適pH6.2を持ち、カルボキシメチルセルロースおよびキシログルカンに対してほぼ等しいKmおよびVmax値を示した。ポプラ培養細胞の成育と酵素活性の変動を調べると、定常期に活性が高くなり、徐々に低下した。無オーキン培地で継代培養したポプラ細胞を1μMオーキンを含む培地で培養すると、Buffer-solubleおよびBuffer-insolubleのキシログルカナーゼ活性はともに対数増殖期に高くなり、定常期に減少した。Extracellular由来の酵素は著しく活性が誘導され、定常期になると消失した。これらの結果から、ポプラ培養細胞は細胞の成長にオーキシンを必要とし、またオーキシンによってキシログルカナーゼが誘導されることが示唆された。ポプラ細胞外培養液よりExt-racellular由来のキシログルカナーゼを電気泳動的に単一バンドを与える蛋白レベルまで完全に精製した。キシログルカナーゼ粗酵素液は、硫安で沈殿させた後、イオン交換(DEAE-トヨパール)、疎水クロマト(Buty1-トヨパール)、ゲル濾過(Superdex G-75)およびイオン交換(MonoQ)により、SDS電気泳動により単一バンドを与えた。
得られたキシログルカナーゼの分子量は50,000、pIは5.5であった。この酵素は、カルボキシメチルセルロースやリン酸膨潤セルロースをよく分解し、キシログルカンに対する分解速度は低かった。酵素分子内にSS結合をもち、サブユニットを持たない。キシログルカナーゼのN末端配列を読み取るために、SDS電気泳動後、ブロッティングを行い、メンブランに結合した酵素蛋白から直接アミノ酸シークエンスを行った。