有機溶媒中リバーゼを触媒とした新規不斉反応による有用物質の高効率生産

1994 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 04556014
• Research Institution: KYOTO UNIVERSITY
• Principal Investigator: 小田 順一 京都大学, 化学研究所, 教授 (50027041)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 加藤 博章 京都大学, 化学研究所, 助手 (90204487) ; 平竹 潤 京都大学, 化学研究所, 助手 (80199075) ; 西岡 孝明 京都大学, 化学研究所, 助教授 (80026559)
• Keywords: リパーゼ / 不斉合成 / エステル交換反応 / 不斉変換 / 有機溶媒 / クローニング / 活性化因子 / 大量発現

Research Abstract

有機溶媒中でリパーゼを触媒とする立体選択的エステル交換反応に第2種不斉変換の概念を応用して、置換ベンズアルデヒドからキラルシントンとして重要な(S)の絶対配置を有する光学活性なシアノヒドリンエステルを100%近い化学収率で合成する動的速度論的光学分割法を確立した。また、固定化の際にトレハロースやシュークロースなどの二糖類を添加して、リバーゼタンパク質に最適量の結合水を保持させることにより最大活性をえることに成功した。さらに、これらの糖の添加によって加熱や親水性有機溶媒に対するリバーゼの耐久性も飛躍的に向上した。活性セリン残基の阻害剤との反応を解析することによって、水溶液中よりもむしろ有機溶媒中において、リパーゼは通常のセリン加水分解酵素としての挙動をとっていることを明らかにした。Pseudo-monas aeruginosa TE3285が生産するリパーゼの遺伝子をクローニングして、大腸菌における大量発現に成功したが、リパーゼタンパク質は不活性な封入体を形成した。また、これまでリパーゼの活性化因子として知られていた遺伝子をクローニングして、大腸菌中で発現させて活性化因子タンパク質を得た。これは活性化因子をタンパク質として精製した最初の例である。先の封入体リパーゼを巻き戻す際に、この活性化因子タンパク質を1:1の割合で添加するとリパーゼの活性が回復した。これによって、活性化因子はタンパク質として発現してから、シャペロン様の役割をはたしていることが明らかになった。これらは、不斉合成反応におけるリパーゼの利用を実用に移すことが直ちに可能であることを示す具体的な内容をふくんでいるばかりでなく、基礎研究の面でもきわめて重要な研究成果といえる。

Research Products

• [Publications] Inagaki,M.: "One-pot synthesis of optically active cyanohydrin acetates from aldehydes via lipase-catalyzed kinetic resolution coupled with in situ formation and racemization of cynohydrins" J.Org.Chem. 57. 5643-5649 (1992)
• [Publications] Chihara-Shiomi,M.: "Purification,molecular cloning,and expression of lipase from Pseudomonas aeruginosa" Arch.Biochem.Biophys.296. 505-513 (1992)
• [Publications] Nakatani,T.: "Chemical inactivation of lipase in organic solvent:A lipase from Pseudomonas aeruginosa TE3285 is more like a typical serine enzyme in an organic solvent than aqueous media" Biosci.Biotech.Biochem. 56. 1118-1123 (1992)
• [Publications] Inagaki,M.: "One-pot synthesis of optically active cyanohydrin acetates from aldehydes via quinidine-catalyzed transhydrocyanation coupled with lipase-catalyzed kinetic resolution in organic solvent" Bull.Chem.Soc.,Jpn.65. 111-120 (1992)
• [Publications] Nakai,K.: "Kinetic resolution of racemic α-aminonitriles via stereo-selective N-acetylation catalyzed by lipase in orqanic solvent" Bull.Inst.Chem Res.Kyoto Univ.70. 333-337 (1992)
• [Publications] Ohshima-Hirayama,N.: "Lipase from Pseudomonas aeruginosa-Production in Escherichia coli and activation in vitro with a protein from the downstream gene" Eur.J.Biochem.215. 239-246 (1993)
• [Publications] 西岡孝明: "Pseudomonas aeruginosa TE3285 リバーゼ活性化遺伝子(lipB)産物の機能" 生物工学. 72. 194-196 (1994)
• [Publications] Shibata,H.: "LipB,private-chaperone for Pseudomonas lipase:Purification and functional studies of the lipase-activator protein" 投稿準備中.