DNAプローブによる住血微生物感染症の早期診断と鑑別法の開発

1992 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 04556043
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 杉本 千尋 北海道大学, 獣医学部, 助教授 (90231373)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岡部 達二 微生物化学研究所, 主任研究員 ; 高橋 清志 酪農学園大学, 酪農学部, 教授 (90048108) ; 小沼 操 北海道大学, 獣医学部, 教授 (70109510)
• Keywords: DNAプローブ / PCR / 住血微生物 / 原虫 / ウシ / ストレス蛋白質 / hsp70

Research Abstract

本年度はまず、染色体DNAプローブをビオチン化し、その反応性を検討した。このプローブを用いた場合、原虫感染後約7日目から特異的な反応が認められた。また、国内の分離株12株を試料とした場合、ドットブロットハイブリダイゼーションで0.1〜0.2μgのDNAが検出できた。つぎに、すでにcDNAクローニングと塩基配列が決定されている原虫表面の主要抗原であるp32の遺伝子配列(平成4年度一般C 課題番号04660314)から、PCR用プライマーを設計した。このプライマーを用いて原虫DNA(70ng〜70μg)を鋳型としてPCRを実施したところ、852塩基対の断片が検出できた。この増幅産物はp32cDNAプローブとドットブロット法で反応したことから、p32DNA遺伝子が特異的に増幅されたものであることが確認された。全国各地から収集した株、および韓国、豪州から入手したタイレリア株のDNAを調製し、PCRを行ったところ同一の長さのDNA断片が検出された。また、他のウシ由来住血微生物、バベシアおよびアナプラズマのDNAからの増幅は陰性であり、PCRの特異性が確認された。検出限界は、感染血液100μ1を用いての検出系では寄生率0.0004%であった。また、PCR反応産物をマイクロプレートに固相化し、ビオチン化cDNAとハイブリダイズさせ、酵素標識アビジンと基質により検出するマイクロプレート法を検討した。この方法でも、PCR産物とプローブとの特異的反応が検出できた。さらに、ピロプラズムの70kDa蛋白質抗原遺伝子をクローニングし、塩基配列を決定したところ、本蛋白質が生物に広く存在する熱ショック蛋白質(hsp70)であることが判明した。そのアミノ酸あるいは塩基配列の非保存領域が診断等に利用可能かさらに検討を加えている。