1992 Fiscal Year Annual Research Report
DNA複製開始部位を利用しての高効率形質発現ベクターの作成と遺伝子治療への応用
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04557105
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
有賀 寛芳 北海道大学, 薬学部, 教授 (20143505)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
有賀 早苗 北海道大学, 医療技術短期大学部, 助教授 (90184283)
上田 正次 雪印乳業(株), 生物科学研究所, 課長
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| Keywords | DNA複製開始 / 形質発現ベクター / 自律増殖配列 / DNA結合タンパク質 / トランスジェニックマウス / c-myc |
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| Research Abstract |
形質発現ベクターとしていままで動物細胞においては動物ウイルスベクターが使用されてきたが、この場合使用できる細胞種が限定されるなどの制限があり満足ゆくものではなかった。我々は動物細胞におけるDNA複製研究を行っており、各種遺伝子上に複製開始領域及び自律増殖配列を同定してきた。自律増殖配列(ARS)は培養細胞やマウス個体で染色体外で自律複製するので形質発現ベクターとして利用できる。今回、更にこれらを詳細に解析した。
我々はヒトc-myc遺伝子、マウス遺伝子などよりARSを単離してきたが、更にヒト熱ショックタンパク質70(hsp70)遺伝子、ヒトN-myc遺伝子、マウスp53遺伝子上にARSを同定し単離した。これらのARSは短期間の培養は勿論のこと、長期間に渡ってARSとして機能している。これらはいづれも、転写調節配列であるエンハンサーやプロモーターを含んでいた。c-myc、hsp70遺伝子、マウスイムノフロブリンH鎖上のARSはその必須配列が同定され、そこに結合して機能するタンパク質が同定された。
c-mycタンパク質/MSSP、c-mycタンパク質/HSBP、OctIがそれぞれ結合した。MSSP、HSBPと名付けたタンパク質はc-mycタンパク質と複合体形成するタンパク質として同定したもので、そのcDNAをそれぞれ2種、1種単離した。この発現系を用いて、c-myc上のARSへの複製への影響を調べたところ、増強活性を示したので今後更に詳細な解析をする予定である。
一方、c-mycARS導入トランスジュニックマウスより回収された複製増強配列(512塩基)の必須配列は約30塩基であり、ここには分子量40Kのタンパク質が結合した。これらのタンパク質はいづれも1本鎖及び2本鎖DNAに塩基配列特異的に結合した。今後、このcis配列、trans因子cDNAを組み合わせてのベクター化を計画している。
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[Publications] Negishi,Y.: "Protein complexes bearing myc-like antigenicity recognize two distinct DNA sequences" Oncogene. 7. 543-548 (1992)
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[Publications] Taira,T.: "c-myc protein comolex binds to two site of the human hsp70 ptomoter region." Biochim.Biophys.Acta. 1130. 166-174 (1992)
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[Publications] Galli,I.: "The AT-rich tract of the SV40 ori core:negative synergism and specific recognition by single stranded and duplex DNA binding proteins" Nucleic-Acids Res.20. 3333-3339 (1992)
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[Publications] Imamura,Y.: "The upstream region of the mouse N-myc gene:identification of an enhancer element that functions preferentially in neuroblastoma..." Biochim.Biophys.Acta. 1132. 177-187 (1992)
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[Publications] Kumano,M.: "Stimulation of SV40 DNA replication by human c-myc enhancer." FEBS Lett.309. 146-152 (1992)
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[Publications] Sato,M.: "Detemination of transrepression domains of of human N-myc protein." Int.J.Onc.1. 539-545 (1992)
