1992 Fiscal Year Annual Research Report
細胞内メタルプロテアーゼの蛍光性ペプチド基質および合成阻害剤の開発
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04558025
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| Research Field |
代謝生物化学
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
川畑 俊一郎 九州大学, 理学部, 助手 (90183037)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
西野 憲和 九州工業大学, 工学部, 助教授 (40145165)
岩永 貞昭 九州大学, 理学部, 教授 (90029942)
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| Keywords | メタルプロテアーゼ / 蛍光性ペプチド基質 / 合成阻害剤 |
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| Research Abstract |
キネテックパラメータの決定に必要なミクロゾームエンドペプチダーゼ(MEP)を得るためにウサギ肝臓20匹分のLubrol抽出液より、Kawabataらの方法を用いて約0.1mgのMEPを精製した。精製時のフラクションアッセイには、従来までのデカペプチド(Ac-A-R-V-R-R-A-N-S-F-L)とフルオレスカミンによる蛍光発色ではなく、今回開発した蛍光消光基質(Abz-A-R-V-R-R-A-N-S-Dna)を用いた。この方法は、5ngの酵素があれば測定可能であり、感度の点では従来の方法と変わらないが、アッセイに要する時間が約1/4に軽減された。加えて、測定誤差も小さく、活性のバックグラウンドが低いのが特徴である。また、MEPによるこの基質の切断位置を確認するために、反応後の基質をHPLCで分離し、アミノ酸分析したところ、MEPは、Arg-Alaの結合を切断していることが確認された。そこで、ビタミンK依存性凝固因子のプロセシング部位を参考にして、9種の蛍光消光基質を合成した。kcat/Kmで判断すると、最も良い基質は、Abz-A-R-V-R-R-F-F-S-Dna(1,210,000M^<-1>s^<-1>)であった。一方、MEPと60%の相同性を有するメタルプロテアーゼ24.15が水解するangiotensin I,LH-RH,dynorphin Aなどのペプチドホルモンに対しては、MEPはまったく反応しなかった。さらに、塩基性アミノ酸を多くの含むヒストンH4、あるいは、プロテアーゼの基質特異性を決定する際に用いられる可溶性還元リゾチームに対してもまったく作用しなかった。ところが、MEPは、αネオエンドルフィンやブラジキニン、BAM-12を非常によく水解した。それらの切断位置を決定してみると、P1部位のアミノ酸に共通性は見られず、MEPのペプチド水解における基質特異性を特定するには至っていない。現在さらに詳しいキネテックを行なっている。また、MEPに特異的なペプチド性のインヒビターの合成を進めており、このペプチダーゼの基質特異性を明かにする予定である。
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[Publications] Shun-ichiro Kawabata: "Rabbit microsomal endopeptidase with substrate specificity for processing proproteins is structurally related to rat testes metalloendopeptidase 24・15." Journal of Biological Chemistry. (1993)
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[Publications] Shun-ichiro Kawabata: "A microsomal endopeptidase from liver with substrate specificity for processing proproteins such as the vitamin K-dependent proteins of plasma." Journal of Biological Chemistry. 267. 10331-10336 (1992)
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[Publications] Sumihiro Hase: "The structure(Xylose)2glucose-o-serine 53 found in the first epidermal growth factor-like domain of bovine blood clotting factor IX." Journal of Biological Chemistry. 265. 1858-1861 (1990)
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[Publications] Sadaaki Iwanaga: "Fibrinogen,Thrombosis,Coagulation,and Fibrinolysis." Plenum Press, 450 (1991)
